Perpustakaan Digital ITB

Pfu polimerase merupakan DNA polimerase termostabil yang diisolasi dari Pyrococcus furiosus. Enzim ini memiliki aktivitas proof-reading sehingga cocok untuk aplikasi sintesis DNA dengan bacaan akurat, seperti kloning, sekuensing dan ekspresi. Namun, aktivitas proof-reading mengakibatkan laju polimerisasi menjadi lambat dan menyebabkan hasil produk amplifikasi rendah. Dalam penelitian ini dikembangkan kit molekuler polimerase Pfu dengan penambahan protein aksesori P45, untuk meningkatkan efisiensi amplifikasi PCR. Protein P45 berfungsi sebagai dUTPase Pfu, pengkatalisis dUTP menjadi dUMP dan PPi. Penambahan dUTPase ke reaksi amplifikasi yang dilakukan oleh polimerase Pfu, secara signifikan dapat mengamplifikasi target gen yang lebih panjang dan meminimalisir penggabungan dUTP. Plasmid pET-16B-Pfu diperoleh dari Addgene, sementara gen P45 dari Freegene disisipkan ke dalam plasmid pET-16B menggunakan metode Gibson assembly. Masing-masing plasmid ditransformasikan ke dalam E. coli BL21(DE3) untuk produksi protein secara terpisah. E. coli transforman yang membawa gen polimerase Pfu atau P45 ditumbuhkan dalam 100 mL LB+ampisilin pada 30oC, agitasi 150 rpm, selama 6 dan 16 jam dengan penambahan IPTG dan tanpa IPTG. Biomassa sel dipanen dan dilisis menggunakan metode sonikasi. Kemudian untuk protein polimerase Pfu dipanaskan pada 95°C selama 30 menit untuk memisahkan agregat protein. Supernatan protein heat stabile dipurifikasi menggunakan kolom Ni-NTA agarosa. Analisis hasil SDS-PAGE menunjukkan kehadiran pita protein polimerase Pfu pada ukuran 90 kDa dengan konsentrasi 0,3 mg/mL. Pada total lisis protein P45 teramati pita dengan ukuran 45 kDa namun tidak ditemukan pada hasil purifikasi. Pengujian aktivitas oleh enzim rekombinan polimerase Pfu menunjukkan adanya aktivitas enzim tersebut. Penelitian ini berhasil mengekspresikan kedua protein polimerase Pfu dan P45 untuk dasar pengembangan kit molekuler PCR, dan perlu dilanjutkan dengan optimasi proses purifikasi protein P45.