Perpustakaan Digital ITB

Protein permukaan yang berada pada dinding sel bakteri Gram-positif memainkan peran penting dalam fisiologi dan patogenesis mikroba ini. Sortase merupakan salah satu jenis protease sistein yang membantu perakitan dan penjangkaran berbagai protein patogen pada permukaan bakteri Gram-positif. Ada enam kelas sortase yang masing-masing memiliki fungsi biologis berbeda, salah satunya sortase D yang banyak terlibat dalam pembentukan spora dan perakitan pili. Sortase D pada Bacillus anthracis berperan dalam pengikatan protein pada dinding sel untuk memfasilitasi sporulasi, sedangkan sortase D pada Bacillus cereus dan bakteri Gram-positif lainnya berperan dalam perakitan pili melalui mekanisme reaksi transpeptidase. Saat ini penelitian mengenai identifikasi sortase D masih terbatas. Oleh karena itu, tujuan penelitian ini adalah untuk menentukan urutan nukleotida gen pengkode sortase D yang berasal dari bakteri laut Rossellomorea aquimaris MKSC 6.2 (RaqsrtD). Penelitian diawali dengan perancangan primer degenerasi berdasarkan informasi urutan nukleotida pengkkode sortase D dari berbagai galur R. aquimaris yang ada pada Genbank. Polymerase Chain Reaction (PCR) degenerasi kemudian dilakukan untuk mengamplifikasi fragmen gen RaqsrtD dari kromosom R. aquimaris MKSC 6.2 dan disisipkan pada vektor kloning pGEM®- T Easy. Sel kompeten Escherichia coli TOP10F’ selanjutnya ditransformasi dengan plasmid rekombinan ini. Tahap terakhir adalah menentukan urutan nukleotida plasmid rekombinan dengan metode dideoksi Sanger. PCR degenerasi menghasilkan fragmen gen yang berukuran 260 pb. Hasil transformasi sel E. coli TOP10F’ dengan pGEM-T-Easy-RaqsrtD260 menghasilkan 4 koloni yang positif analisis PCR koloni. Analisis urutan nukleotida dari 4 koloni ini menggunakan blastx pada laman NCBI, menunjukkan bahwa fragmen gen RaqsrtD berukuran 263 pb dan memiliki kemiripan urutan nukleotida (98,84%) dengan sortase kelas D dari Bacillus sp. Marseille-Q1617 dan dengan R. aquimaris galur CH159a_5T dan galur CH87b_3T sebesar 88,37%. Hasil ini melandasi pembuatan primer untuk mengamplifikasi gen RaqsrtD utuh (sekitar 560 pb). Penentuan urutan gen sisipan pada plasmid rekombinan pGEM-T-Easy-RaqsrtD memberikan informasi ukuran gen RaqsrtD yang mengkodekan mature protein sepanjang 540 pb. Urutan nukleotida RaqsrtD memiliki persentase kemiripan sebesar 99,47% dengan urutan nukleotida pengkode sortase D dari Bacillus sp. Marseille- Q1617. Studi penentuan urutan nukleotida sortase D ini akan membuka peluang karakterisasi lebih lanjut mengenai enzim ini untuk mengembangkan obat dalam pencegahan infeksi oleh bakteri Gram-positif.