Perpustakaan Digital ITB

Prevalensi penyakit alergi mengalami peningkatan secara global, yang disebabkan oleh berbagai faktor, seperti faktor genetik dan faktor lingkungan. Penyebab terjadi alergi karena adanya reaksi abnormal atau reaksi berlebihan (hipersensitivitas) sistem kekebalan tubuh dalam mengenali suatu antigen/alergen yang dianggap berbahaya. Mekanisme seluler alergi terjadi akibat proliferasi sel T yang tidak seimbang sehingga berpengaruh terhadap homeostasis sel imun bawaan dan adaptif. Terdapat beberapa pengobatan yang dilakukan untuk menekan atau mengurangi gejala alergi, seperti: (i) menghindari penyebab alergi, (ii) pemberian antihistamin, serta (iii) imunoterapi menggunakan Oligodeoxynukleotida (ODN). Penggunaan ODN sebagai agen terapi banyak dimanfaatkan pada penderita alergi karena ODN dapat mengontrol fungsi seluler dengan terjadinya ikatan dengan protein reseptor sehingga dapat menstimulasi keadaan setimbang pada tubuh. Penggunaan ODN sintetik banyak memanfaatkan aktivasi Toll-like Receptor-9 (TLR-9) dengan pengenalan motif Cytosine Phosphate Guanine (CpG) yang tidak termetilasi, namun enzim nuklease menjadi salah satu kendala dalam pemanfaatan CpGODN untuk terapi. Oleh karena itu, perlu dilakukan modifikasi untaian CpGODN agar diperoleh untaian yang stabil dan fungsional. Pada tahap pertama penelitian, dilakukan pembuatan desain G-quadruelex (G4) CpG ODN dan telah didapatkan 11 desain G4CpGODN yang menunjukkan topologi antiparalel dengan ciri titik puncak pada 290 nm dan titik lembah pada 260 nm menggunakan analisis Circular Dichroism Spectrophotometry. Desain G4CpGODN tersebut dapat menjaga topologi antiparalel dengan penambahan satu atau dua motif CpG pada untaian pertama, ketiga serta daerah duplex yang terdapat pada bagian D0G0.0.0. Selain itu, penambahan basa diantara G-tetrad dan motif CpG juga memberikan efek yang berbeda pada struktur topologi. Efek stimulasi desain baru G4CpGODN pada lini sel makrofag mencit RAW 264 menunjukkan bahwa semakin panjang untaian pada untaian pertama, terbukti dapat meningkatkan ekspresi mRNA sitokin. Pada desain dengan panjang optimum untaian adalah 16 basa nukleotida dapat meningkatan ekspresi mRNA mIL-6, mIL-12 dan mIFN-? sebesar 143,8; 9,7 dan 3,8 kali, secara berurutan. Pada penelitian tahap kedua, karakterisasi 11 desain antiparalel G4CpGODN dilakukan menggunakan analisis: (i) Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), (ii) stabilitas menggunakan serum, serta (iii) Melting Temperature (MT) yang kemudian dilanjutkan dengan (iv) uji secara in vitro menggunakan lini sel dendritik mencit dan sel primer makrofag sum – sum tulang (bone marrow) mencit C57BL/6. Pada analisis PAGE yang telah dilakukan, bentuk linear digunakan sebagai pembanding pada analisis untuk setiap desain. Hasil yang didapatkan, sebelas desain yang telah didapatkan tersebut mampu mempertahankan struktur Gquadruplex yang ditandai dengan mobilitas yang lebih cepat dibandingkan dengan bentuk linearnya pada analisis ini. Empat desain dengan satu basa penghubung antara CpG motif dan G-tetrad (D0Ga2a.0.0; D0Ga2c.0.0; D0Gc2c.0.0; D0Gc2a.0.0) menampilkan hasil terbaik dengan nilai stabilitas pada serum yang tinggi setelah 24 jam inkubasi dibandingkan dengan desain lainnnya dengan nilai secara berurutan yaitu 26,3%; 24,3%; 30,8%; dan 17,9%. Pada analisis nilai melting temperature, didapatkan urutan desain dengan hasil tertinggi anatara lain desain asli, D0G0.0.0; D0G1.0.0; D0G2.0.0; D0Ga2a.0.0; D0Gac2ac.0.0; D0Gca2ac.0.0; D0G0.0.2; D0Gc2c.0.0; D0Gca2ca.0.0; D0Ga2c.0.0; dan D0Gc2a.0.0. Berdasarkan pengujian lini sel makrofag mencit RAW 264 pada tahap pertama, didapatkan hasil bahwa ekspresi gen sitokin tertinggi ditunjukkan pada sel yang distimulasi dengan D0Ga2c.0.0 dan D0Gc2c.0.0, sehingga pada tahap kedua, dilakukan stimulasi pada lini sel dendritik mencit DC2.4 dan sel primer makrofag dari Bone Marrow (BM-MCs) mencit menggunakan D0Ga2c.0.0 dan D0Gc2c.0.0, dan D0G2.0.0 digunakan sebagai kontrol positif dan D-PBS digunakan sebagai kontrol negatif. Hasil yang didapatkan yaitu D0Gc2c.0.0 mengekspresikan gen sitokin tertinggi pada stimulasi sel DC2.4 dan BM-MCs sel primer mencit C57BL/6. Namun, pada pengujian lebih lanjut, hanya D0Ga2c.0.0 yang akan digunakan untuk pengujian secara in vivo dengan dasar nilai residual ODNs setelah 24 jam inkubasi pada serum. Capaian dari penelitian disertasi ini yaitu untuk mendapatkan desain yang memiliki resistansi pada enzim nuklease yang tinggi. Berdasarkan tahap pertama dan kedua, desain D0Ga2c.0.0 memiliki kemampuan dalam mengurangi efek degradasi nuklease yang tinggi dibandingkan dengan desain lainnya. Pada penelitian tahap ketiga, desain D0Ga2c.0.0 digunakan sebagai aplikasi in vivo untuk mengetahui efek desain G4CpGODN terhadap mencit yang telah diberi perlakuan alergi menggunakan ovalbumin. Terdapat tiga perlakuan pembanding yang digunakan, yaitu perlakuan D-PBS, model alergi serta model alergi + perlakuan D0Ga2c.0.0. Analisis ELISA mIgE pada plasma darah dari mencit pada hari sebelum perlakuan ovalbumin dan setelah perlakuan ovalbumin mengalami peningkatan dan penurunan dialami pada mencit dengan perlakuan G4CpGODN. Hasil yang sama didapatkan juga pada analisis mOva-IgE. Hal ini menunjukkan bahwa CpG dapat mengurangi total mIgE serta mOva-IgE pada plasma darah. Hasil analisis histologi menunjukkan bahwa pemberian G4CpGODN mampu menurunkan secara signifikan jumlah sel yang terlibat dalam mekanisme alergi serta kadar mukus dibandingkan dengan kelompok kontrol. Penelitian ini memberikan alternatif baru guna mengurangi efek degradasi nuklease pada motif CpG dengan memanfaatkan struktur sekunder, yang disebut G-quadruplex. Secara singkat, motif Cytosine Phosphate Guanine (CpG) dapat dikenali oleh reseptor pada sel imun, seperti makrofag, sel B dan sel dendritik mencit yang menghasilkan sinyal kaskade untuk mengurangi gejala alergi.