Perpustakaan Digital ITB

Reverse transcriptase (RT) adalah jenis enzim polimerase yang memiliki kemampuan untuk menyintesis DNA dengan templat RNA. Salah satu enzim RT yang umum digunakan adalah enzim RT dari Moloney Murine Leukemia Virus (MMLV RT). Diketahui bahwa MMLV RT memiliki aktivitas katalitik dan fidelitas yang lebih tinggi dari enzim RT lainnya. Namun, beberapa karakteristiknya secara umum masih memerlukan peningkatan, contohnya termostabilitas dan processivity. Pada penelitian sebelumnya, telah dirancang secara in silico protein fusi antara MMLV RT dengan salah satu anggota famili protein 7 kDa DNA-binding dari Archaea, yaitu Sis7a. Protein ini bersifat termostabil dan memiliki kemampuan untuk berikatan dengan DNA. Penggabungan kedua protein tersebut diharapkan dapat meningkatkan performa enzim MMLV RT, terutama dalam hal processivity dan kemampuan untuk mempertahankan aktivitas pada suhu yang lebih tinggi. Namun, rancangan enzim rekombinan tersebut belum dieskpresikan secara in vitro, sehingga penelitian ini bertujuan untuk mencari kondisi yang optimal dalam mengekspresikan enzim rekombinan melalui penentuan parameter konsentrasi induser dan durasi induksi. Plasmid yang telah dikonstruksi dikloning ke dalam Escherichia coli DH5?. Kemudian, dilakukan transformasi isolat plasmid hasil kloning ke dalam E. coli BL21 (DE3). Keberhasilan transformasi dikonfirmasi melalui metode PCR dan sekuensing DNA. Selanjutnya, dilakukan induksi pada suhu tumbuh optimal dari bakteri rekombinan, yaitu 37oC. Plasmid yang telah dikonstruksi dikloning ke dalam Escherichia coli DH5?. Kemudian, dilakukan transformasi isolat plasmid hasil kloning ke dalam E. coli BL21 (DE3). Keberhasilan transformasi dikonfirmasi melalui metode PCR dan sekuensing DNA. Selanjutnya, induksi dilakukan pada suhu tumbuh optimal dari bakteri rekombinan, yaitu 37oC, dengan menggunakan kombinasi parameter durasi, yaitu 3, 4, dan 5 jam, dengan konsentrasi induser yang digunakan, yaitu 0 mM, 0.25 mM, 0.50 mM, dan 0.75 mM. Kultur bakteri rekombinan dipanen untuk selanjutnya dilakukan fraksinasi protein terlarut dan tidak terlarut. Kemudian dilakukan analisis ekspresi protein rekombinan dengan metode SDS-PAGE. Pita protein yang diperoleh diolah menggunakan perangkat lunak ImageJ dan dianalisis secara statistik. Hasil konfirmasi PCR dan sekuensing DNA menunjukkan bahwa tranformasi berhasil dilakukan pada E. coli DH5? dan E. coli BL21 (DE3). Pada E. coli BL21 (DE3), protein rekombinan diekspresikan dalam fraksi terlarut dan tidak terlarut. Pada fraksi terlarut, variasi durasi induksi memberi pengaruh signifikan secara statistik (p<0.05), sedangkan variasi konsentrasi IPTG tidak memberikan perbedaan yang signifikan (p>0.05). Variasi induksi terbaik untuk protein fraksi terlarut adalah 3 dan 4 jam. Pada fraksi tidak terlarut, baik variasi durasi induksi maupun konsentrasi IPTG, keduanya memberikan pengaruh yang signifikan terhadap jumlah protein rekombinan yang dihasillkan. Dengan demikian, dapat disimpulkan bahwa dalam penelitian ini telah berhasil diekpresikan enzim MMLV RT yang difusikan dengan Sis7a. Dipilih kondisi induksi di suhu 37oC dengan durasi selama 4 jam, tanpa menggunakan IPTG untuk memperoleh enzim dalam fraksi terlarut. Penelitian selanjutnya harus dilakukan untuk karakterisasi dan menguji aktivitas dari enzim rekombinan yang dihasilkan.