Perpustakaan Digital ITB

Kanker adalah penyakit yang ditandai dengan pembelahan sel yang tidak terkendali. Sel kanker memiliki kemampuan untuk menyerang jaringan biologis lainnya, baik dengan pertumbuhan langsung di jaringan yang bersebelahan (invasi) atau dengan migrasi sel ke tempat yang jauh (metastasis). Urokinase-type plasminogen activator (uPA) merupakan kelompok enzim serine protease yang berperan penting dalam proses regulasi fisiologis dan patologis. Pengikatan uPA dengan membran spesifik reseptor uPA (uPAR) dapat mendegradasi matriks ekstralseluler (ECM) dan menyebabkan progresi sel tumor, invasi, dan metastasis. Penelitian penghambatan aktivitas uPA dinilai dapat meningkatkan efisiensi terapi kanker. Pengobatan kanker selama ini dilakukan dengan kemoterapi, imunoterapi, terapi hormon atau radiasi. Uji dua obat sintetik inhibitor uPA, yaitu paminobenzamidin dan amilorida, terbukti dapat menurunkan tumor prostat. Doxorubicin, salah satu antibiotika golongan antrasiklin, digunakan sebagai obat terapi kanker. Meskipun banyak obat-obat sintetik lain yang digunakan untuk terapi kanker, namun obat sintetik dapat menginduksi kanker sekunder. Senyawa bahan alam dan turunannya dapat menjadi alternatif obat sintetik. Senyawa bahan alam dan analognya banyak digunakan dalam penemuan obat baru dengan memanfaatkan diversitas struktur kimianya. Penemuan obat antikanker dapat dilakukan melalui pencarian senyawa aktif atau penapisan secara acak calon senyawa obat dari suatu basis data berdasarkan target makromolekul spesifik pada jaringan kanker. Penapisan virtual berbasis struktur (structure-based virtual screening, SBVS) dari Database Herbal Indonesia (HerbalDB) menggunakan model farmakofor berbasis struktur, digunakan untuk mengidentifikasi dan mendesain inhibitor poten terhadap target enzim uPA. Verifikasi model farmakofor menggunakan Demanding Evaluating Kits for Objective In Silico Screening database (Dekois 2.0). Model farmakofor yang tervalidasi dan 1412 ligan dari HerbalDB diinput secara online ke Pharmit (http://pharmit.csb.pitt.edu) dan digunakan aturan Lipinski dalam melakukan penapisan virtual. Senyawa hits yang dihasilkan ditentukan skor penambatan (skor S) menggunakan protokol penambatan molekul Moleculer Operating Environtment (MOE 2009.10). Validasi program penambatan molekul menggunakan pengecoh (decoys) dari A Directory of Useful Decoys (DUD) yang terdiri dari 162 senyawa aktif dan 9840 senyawa pengecoh (decoys). Ditentukan senyawa dengan skor S yang lebih negatif dibandingkan dengan senyawa lain, dan ditentukan interaksi ikatannya dengan residu asam amino. Prediksi farmakokinetika senyawa hits menggunakani website pkCSM. Kestabilan kompleks senyawa - enzim uPA hasil penambatan molekul, ditentukan dengan simulasi dinamika molekul (molecular dynamics atau MD). Simulasi dilakukan hingga sistem berada dalam keadaan stabil (berdasarkan analisis energi, tekanan, temperatur, Root Mean Square Deviation (RMSD) dan Root Mean Square Fluctuation (RMSF). Energi bebas pengikatan ditentukan dengan perhitungan Molecular Mechanics-Poisson Boltzmann Surface Area (MM-PBSA). Salah satu pengembangan senyawa bahan alam sebagai kandidat obat dapat dilakukan melalui pembentukan senyawa analog atau turunannya. Quercetin (3,3’,4’,5’7- pentahidroksiflavon) terdapat pada sayuran dan buah-buahan seperti brokoli dan apel, telah diteliti untuk pencegahan atau pengobatan penyakit kanker. Asetilasi dari senyawa hit quercetin, merupakan salah satu pembentukan analog yang dapat meningkatkan bioavailabiltas. Asetilasi menggunakan pereaksi anhidrida asetat dan katalisator natrium asetat selama 2 jam pada suhu 0 ?C untuk mensintesis 3,3’,4’,7- tetraacetylquercetin (Senyawa 1) dan pereaksi anhidrida asetat dan katalisator piridin selama 6 jam pada suhu kamar untuk mensitesis 3,3’,4’,5,7-pentaacetylquercetin (Senyawa 2). Karakterisasi produk sintesis diidentifikasi dengan FT-IR, ESI-MS, dan spektroskopi 1H- dan 13C-NMR. Penambatan molekul, visualisasi hasil penambatan, prediksi farmakokinetika, simulasi diamika molekul, dan perhitungan energi pengikatan berdasarkan MM-PBSA terhadap analog senyawa 1 dan 2 telah dilakukan. Uji in vitro inhibitor uPA senyawa hasil penambatan dan kedua senyawa analog dilakukan dengan menggunakan metode spektrofluorometri berdasarkan pemutusan 7- amino-4-trifluorometilcoumarin (AFC) dengan basis substrat membentuk AFC yang berfluoresensi (?ex = 350 nm/?em = 450 nm). Nilai % Inhibisi Relatif merupakan hasil dari intensitas fluoresensi terhadap waktu dalam rentang waktu tertentu (setiap 5 menit). Perhitungan nilai IC50 dilakukan dengan menggunakan kurva sigmoid dengan nilai slope berdasarkan Hill coefficient. Hasil verifikasi farmakofor menunjukkan Model _3 yang menurut skema PCH terdiri dari empat fitur farmakofor, yaitu dua cincin aromatik (F1 dan F2), kation donor ikatanH (F3), dan ligator logam S (F4) yang memenuhi persyaratan pemodelan farmakofor dengan skor hit Enrichment Factor (EF), Goodness of Hit Score (GH), sensitivitas, dan spesifisitas yaitu 2,48; 0,723; 0,6; dan 0,94. Oleh karena itu Model_3 dapat digunakan untuk penapisan virtual untuk mendapatkan senyawa hits. Penapisan virtual menghasilkan 72 senyawa hits. Validasi penambatan molekul dengan redocking menunjukkan nilai RMSD 0,5174, Area Under the Curve (AUC) 0,709 dan EF-1% 61,74. Empat senyawa hits dengan skor S yang lebih negatif dibandingkan senyawa lain, yaitu isorhamnetin, rhamnetin, quercetin dan kaempferol (-129,64; -128,37; - 126,03 dan -116,83 kkal/mol) merupakan golongan flavonol. Isorhamnetin dan rhamnetin adalah senyawa O-metil flavonol (3’-metoksi quercetin dan 7-metoksi quercetin) dan Kaempferol adalah 3,4’,5,7-tetrahidroksiflavon. Prediksi farmakokinetika isorhamnetin dan rhamnetin lebih mudah diabsorbsi, didistribusikan, dan diekskresikan dibandingkan dua senyawa hits lainnya. Metabolisme keempat senyawa sebagai inhibitor enzim metabolisme CYP1A2 dan nilai toksisitas LD50 < 5000 mg/kg (berbahaya bila tertelan). Nilai RMSD rata-rata terendah selama waktu simulasi adalah 1,97 ± 0,10 untuk Isorhamnetin. Nilai RMSD dan RMSF dari simulasi dinamika molekular menunjukkan bahwa kompleks uPA-senyawa dalam keadaan stabil, fluktuasi keempat senyawa dengan residu Cys43 dan Trp44 dimana quercetin menunjukkan nilai RMSF-nya terkecil. Energi bebas pengikatan isorhamnetin, rhamnetin, dan kaempferol lebih tinggi dibandingkan quercetin. Hasil sintesis senyawa 1 dan 2 dimurnikan menggunakan metode kromatografi kolom klasik dan KLT. Dihasilkan kristal putih kekuningan dengan rendemen senyawa 1 dan 2 sebesar 41,37 % dan 46,05%. Titik leleh senyawa 1 dan 2 adalah 159-161,1 ?C dan 172-174,3 ?C. Identifikasi senyawa 1 dilakukan dengan kromatografi kolom, KLT, dan KLT dua dimensi. Senyawa 2 dimurnikan dengan etil asetat dan diidentifikasi dengan KLT. Dari identifikasi dengan FT-IR, senyawa 1 menunjukkan adanya puncak pada 3994 cm-1 yang menunjukkan adanya gugus OH, tetapi tidak muncul pada senyawa 2. Spektrum 1H-NMR senyawa 1 pada H-6, 8, 5’, 6’, 2’, CH3, dan OH. Spektrum 13CNMR menunjukkan sinyal karbon dengan empat sinyal karbonil dan metil. Spektrum 1H-NMR senyawa 2 pada H-6, 8, 5’, 6’, 2’, dan CH3. Spektrum 13C-NMR sinyal karbon teramati lima sinyal karbonil dan metil. Hasil spektroskopi massa (ESI-MS) senyawa 1 ditunjukkan pada m/z C23H18O11 terhitung [M+Na]+ 493,38 dan senyawa 2 ditunjukkan pada m/z C25H20O12 terhitung [M+Na]+ 535,09. Nilai skor S kedua senyawa lebih rendah dari quercetin karena berkurangnya ikatan hidrogen dari gugus OH. Prediksi absorbi, distribusi, dan ekskresi kedua senyawa lebih baik bila dibandingkan dengan quercetin. Senyawa 1 dan 2 diprediksi sebagai inhibitor dan non inhibitor CYP1A2 dan nilai toksisitas LD50 < 5000 mg/kg. Hasil uji in vitro inhibitror uPA, quercetin, senyawa 1, dan 2 menunjukkan slope yang memenuhi persyaratan, yaitu diantara 1,30 - 2,31. Respon berhubungan dengan slope dan konsentrasi, bila slope meningkat, maka konsentrasi bertambah besar. Nilai IC50 senyawa 1 dan 2 lebih negatif dibandingkan dengan quercetin sebagai senyawa induk dan ketiga senyawa hits lainnya. Berdasarkan hasil penelitian disimpulkan bahwa senyawa 2 (3,7,3’,4’,5-pentaasetil quercetin) paling kuat menghambat enzim uPA dan dapat dikembangkan dalam desain struktural sebagai inhibitor uPA baru.