Perpustakaan Digital ITB

Reverse transcriptase (RTase) merupakan protein yang mengkatalisis sintesis DNA dari cetakan RNA dan merupakan komponen penting pada Reverse Transcription Quantitative Polymerase Chain Reaction (RT-qPCR). RTase Moloney Murine Leukemia Virus (MMLV) mutan (RTM) bersifat resisten terhadap inhibitor proses RT-qPCR dan tidak memiliki aktivitas RNase H, sehingga dapat meningkatkan rendemen cDNA hasil proses transkripsi balik. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan overproduksi, purifikasi dan karakterisasi protein RTM rekombinan di Escherichia coli BL21(DE3), sehingga diperoleh protein RTM yang dapat digunakan dalam proses transkripsi balik secara in vitro. Protein RTM dikonstruksi dengan pendekatan optimasi kodon menggunakan plasmid pET-28a dengan hasil Codon Adaptation Index (CAI) 0,773 dan %GC sebesar 54,7%. Overproduksi RTM dilakukan dengan ko-ekspresi Trigger Factor (TF) dan GroEL-GroES. Overproduksi protein RTM pada kondisi optimal suhu 28 ?, induksi IPTG 0,5 mM dan tetrasiklin 20 ng/mL menunjukkan fraksi RTM terlarut 94,52 ± 1,73% dan rendemen 39,22 ± 4,63%. Purifikasi RTM dilakukan menggunakan kromatografi kolom afinitas Ni-NTA Sepharose dengan elusi imidazol 250 mM. RTM murni dihasilkan dengan rendemen 42,58 ± 3,27% dan tingkat kemurnian 88,73 ± 3,19%. Penentuan aktivitas serta uji stabilita penyimpanan dan pengaruh keberadaan inhibitor RTase dan sampel klinis dilakukan dengan metode RT-qPCR dan SDS PAGE. Protein RTM memilki aktivitas RNA-dependent DNA polimerase dengan aktivitas spesifik sebesar 1981,03 U/mg, dan stabil selama 15 minggu penyimpanan pada suhu -20 ?. Selain itu, RTM tetap aktif dengan keberadaan inhibitor RTqPCR, yaitu VTM SARS-CoV-2 hingga 39%, dan sampel klinis berupa plasma darah hingga 5%, dan darah lengkap hingga 2%. Proses overproduksi, purifikasi, dan karakterisasi protein RTM telah berhasil dilakukan dengan karakter kestabilan dan resisten inhibitor RTase yang baik menunjukkan bahwa protein dapat digunakan dalam proses transkripsi balik secara in vitro.