Perpustakaan Digital ITB

Lipase merupakan enzirn hidrolase ) ang ban) ak dirnanfaatkan dalam dunia indu tri. seperti makanan. kosrnetik. farrnasi. detergen dan biodiesel. Hal tersebut rnendorong untuk dilakukannya produksi lipase dalamjurnlah besar rnelalui teknik rekombinan. Lima klon gen pengkode lipase termostabil telah dipcroleh pada pcnelitian sebelumn) a melalui pendekatan mctagenome. salah satu nya diberi nama gcn LKI yang telah di ekspresikan dalam Escherichia coli namun menghasilkan cnzim dengan aktivitas yang rendah diduga karena mengalami inclusion bo( l". Penelitian ini bcrtujuan untuk mendapatkan lipase termostabil yang mcmiliki aktivitas tinggi dan tidak mengalami inclusion boi(v melalui ckspresi gen LKI dalam Pichia pasloris. Beberapa tahapan strategi dalam penelitian ini diantaranya dilakukan pen) iapan plasmid rckombinan pPICZaA-LK I melalui subkloning gen LKI dari vektor pET30a( +) ke dalam vektor plasmid pGEMT sehingga didapatkan plasmid rekombinan pGEMT-LK I. Plasmid rekombinan yang diperoleh dipotong dengan enzim resktriksi EcoRJ dan Xbal untuk mendapatkan gen LK I. gen tersebut selanjutnya disisipkan kedalam vektor ekspresi pPICZaA sehingga d iperoleh plasmid rekombinan pPICZaA-LKI. Plasmid tersebut di linearisakan dengan enzim restriksi Sad yang kemudian digunakan untuk mentransformasi Pichia pastoris dengan metode elektroporasi. Pada tahap ini didapatkan Pichia pastoris )ang membav,:a plasmid pPICZaA-LK I didalam kromosomnya. Sebelum dilakukan ekspresi. transforman )ang didapatkan di seleksi terlebih dahulu dengan memindahkan transforman dari media YPD dengan konsentrasi zcosin I 00 11g/mL ke zeosin dengan konsentrasi :WOO f..Lg/mL. Beberapa transforman :ang tumbuh baik pada media YPD dengan konsentrasi zeosin :WOO f..Lg/mL kemudian di uji fenotif n;.a menggunakan PCR koloni. Selanjutnya d ilakukan ekspresi dalam sel inang Pichia pastoris GS115 dcngan induksi metanol I % selama 5 hari. Protein ) ang didapatkan kemudian dimurnikan dengan kromatografi afinitas Ni-NTA dimana hasil pemurniann)a di dialisi s. Enzim murni )ang sudah didapatkan kemudian di analisis mcnggunakan SDS-PAGE (Sodium Dode( :rl .)'u/phate-Po mcry!amide Gel E!ectrophore\.is) dan di lakukan pengukuran akti v itas spesifik dengan substrat p-nitrofenol laurat (pNp-Laurat) pada pH 8 dan suhu 50°C. Diperoleh gen LK I berukuran -I 000 pb untuk penggunaan primer LK3 dan ukuran -1500 pb untuk penggunaan primer AOX I melalui metode PCR (Polymerase Chain Reaction). Ekspresi gen telah dilakukan menggunak.an transforman fenotif mut+ melalui penambahan induser meta noI I % selama 5 hari pada 30°C dengan pcngocokan berkecepatan 150 rpm. Protein telah berhasil dimurnikan dcngan kromatografi N i- TA yang ditunjut...k.an oleh hasil analisis SDS-PJ\GE d imana didapatkan pita protein lipase LK I berukuran 35.49 kDa dan diperoleh hasil uji aktivitas spesifik enzim sebesar 3.51 U/mg dengan kemurnian 1 0.8 kali dan )ield sebesar 92.86%.