Perpustakaan Digital ITB

Sistem seleksi berbasis antibiotik dalam teknologi DNA rekombinan telah dibatasi penggunaannya oleh badan regulasi terkait masalah keamanan sehingga dapat diganti dengan sistem seleksi lain seperti sistem seleksi auksotrof. Sistem seleksi auksotrof membutuhkan sel inang mutan yang tidak dapat mensintesis suatu senyawa organik yang berperan dalam viabilitasnya. Salah satu metode mutagenesis terarah terhadap kromosom sel inang adalah Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associated protein 9 (CRISPR-Cas9) dan rekombinasi homolog ?- red. CRISPR-Cas9 melibatkan endonuklease Cas9, sgRNA, 20 nukleotida spesifik gen target (untuk dapD, N20dapD), protein rekombinase ?-red, dan fragmen homolog H1H2. Komponen tersebut terdapat dalam plasmid pRed-cas9-recA-dapD yang ditujukan untuk memutasi gen dapD pada E. coli DH5?dan dirancang serta dikonstruksi pada penelitian ini. Tujuan penelitian ini adalah mengkonstruksi E. coli DH5?(?dapD) galur auksotrof lisin dan mengkonfirmasinya. Penelitian ini diawali dengan menentukan N20dapD dan fragmen homolog H1H2 secara in silico yang dilanjutkan dengan mengkonstruksi plasmid pRed-cas9-recA-dapD dengan mengganti urutan N20 dan fragmen homolog H1H2 pada plasmid pRed-cas9-recA ?poxB. Plasmid pRed-cas9-recA-dapD kemudian dikonfirmasi dengan analisis migrasi dan pemotongan. Plasmid lalu ditransformasikan ke dalam E. coli DH5? dengan metode elektroporasi. Kultur E. coli DH5?yang telah memiliki plasmid diberikan L-arabinosa dengan konsentrasi akhir 2 g/L untuk induksi mutasi. Konfirmasi mutasi dilakukan dengan Polymerase Chain Reaction (PCR) koloni, lalu koloni yang telah termutasi dihilangkan plasmidnya melalui mekanisme curing dengan inkubasi di 37°C. Sebanyak empat koloni E. coli DH5?mutan galur auksotrof lisin memberikan hasil positif pada analisis genotipe melalui PCR dan secara fenotipe melalui media seleksi. Dengan demikian penelitian ini berhasil mendapatkan E. coli DH5?(?dapD) mutan galur auksotrof lisin yang sudah terkonfirmasi kebenarannya secara fenotipe dan genotipe. Pada penelitian lanjutan E. coli DH5?galur mutan ini dapat digunakan untuk seleksi sistem plasmid yang membawa gen dapD seperti pCAD-sod-cer-dapD.