Perpustakaan Digital ITB

α-Amilase adalah salah satu enzim yang menghidrolisis ikatan internal α-1,4-glikosidik pada pati. Enzim ini diklasifikasikan ke dalam keluarga Glikosida Hidrolase (GH13). Enzim pada keluarga ini memiliki residu katalitik lestari. Hasil-hasil penelitian melaporkan bahwa residu katalitik enzim ini terdiri dari dua aspartat dan satu glutamat. Salah satu bakteri penghasil α-amilase adalah Bacillus megaterium NL3. α-Amilase dari bakteri ini memiliki residu katalitik yang berbeda dari α-amilase lainnya. Dua aspartat tidak berada pada daerah lestari. Namun, glutamat berada pada daerah lestari. Diduga terdapat residu lain yang mungkin terlibat dalam katalisis. Pada penelitian ini residu yang berperan dalam katalisis dipelajari dengan srategi mutasi terarah. Oleh karena itu, produksi α-amilase rekombinan Bacillus megaterium NL3 (BmaN1) dengan dan tanpa mutasi pada fraksi terlarut perlu dilakukan. Penelitian ini bertujuan untuk memproduksi BmaN1 dengan dan tanpa mutasi pada Escherichia coli ArcticExpress (DE3) serta memurnikan dan menentukan aktivitas protein BmaN1 dengan dan tanpa mutasi. Mutan-mutan BmaN1 terdiri dari Glu231Gln, His294Asp, dan Lys202Asp. Penelitian ini merupakan penelitian eksperimen yang terdiri dari beberapa tahap, yaitu produksi, pemurnian, dan karakterisasi secara biokimia protein BmaN1 dengan dan tanpa mutasi. Protein-protein ini telah berhasil diproduksi di Escherichia coli ArcticExpress (DE3) selama 24 jam dengan induser isopropil β-D-1-tiogalaktopiranosida (IPTG). Berat molekul protein-protein ini adalah ~55 kDa yang dikarakterisasi oleh sodium dodesil sulfat-gel elektroforesis poliakrilamid (SDS-PAGE). Protein-protein ini ada yang larut dan tidak larut (badan inklusi). Badan inklusi lebih dominan dibandingkan fraksi terlarut. Aktivitas spesifik protein larut BmaN1 sebesar 0,190 U/mg; mutan Glu231Gln sebesar 0,028 U/mg; mutan His294Asp sebesat 0,145 U/mg; dan tidak ada aktivitas enzimatik untuk mutan Lys202Asp. Badan inklusi dilipat ulang dan dimurnikan dengan kromatografi afinitas Ni-NTA. Aktivitas spesifik hasil pelipatan ulang BmaN1 sebesar 54,24 U/mg; mutan Glu231Gln sebesar 12,49 U/mg; mutan His294Asp sebesar 25,73 U/mg; dan mutan Lys202Asp tidak memiliki aktivitas enzimatik. Hasil penelitian menunjukkan bahwa protein-protein yang dihasilkan berupa protein larut dan badan inklusi. Kelarutan protein cenderung disebabkan oleh chaperonin yang membantu proses pelipatan protein dengan tepat. Badan inklusi terbentuk karena adanya bagian hidrofobik pada struktur BmaN1. Nilai aktivitas spesifik protein larut dan hasil pelipatan ulang dibandingkan. Aktivitas spesifik residu Glu231 konsisten karena menghilangkan kemampuan protonasi. Aktivitas spesifik Lys202 konsisten sehingga dapat dianggap berperan penting dalam katalisis. Aktivitas spesifik His294 tidak konsisten sehingga harus digunakan pendekatan lain untuk membuktikan peranan His294 pada katalisis BmaN1. Berdasarkan hasil tersebut residu Glu231 dan Lys202 mungkin berperan dalam katalisis.