Perpustakaan Digital ITB

?-Amilase dari rekombinan Bacillus megaterium NL3 (BmaN2) yang diperoleh dari Danau Kakaban, Kalimantan Timur, Indonesia merupakan salah satu enzim pendegradasi pati mentah tanpa proses gelatinisasi. BmaN2 diyakini memiliki residu yang berperan dalam pengikatan substrat yang disebut Surface Binding Site (SBS) yaitu Tyr101, His141, Trp179 dan Trp198. Pada penelitian sebelumnya, telah dilakukan profil aktivitas hidrolisis pati oleh Mutan BmaN2/H141K pada sel inang Escherichia coli BL21 (DE3) namun terjadi pembentukan agregasi. Sehingga perlu dilakukan penggantian sel inang untuk mutan BmaN2/H141K. Adapun tujuan dari penelitian ini adalah untuk Menentukan karakteristik ekspresi gen pengode BmaN2 H141K pada sel Escherichia coli BL21 PlysS dan Escherichia coli BL21 CodonPlus-Ripl dan menentukan profile aktivitas hidrolisis varian BmaN2 H141K terhadap pati mentah dan pati terlarut. Pada penelitian ini, Sel Escherichia coli BL21 PlysS dan Escherichia coli BL21 CodonPlus-Ripl ditransformasi dengan pET- 30a(+)_bmaN2 rekombinan dan ditumbuhkan pada media padat Luria Bertani (LB) yang mengandung antibiotika kanamisin dan chloromphenicol. Transforman yang tumbuh dianalisis dengan penambahan induser isopropil ?-D-1-tiogalaktopiranosida (IPTG) 0,1 mM selama 4 jam pada suhu 37°C. BmaN2 selanjutnya dimurnikan dengan kromatografi afinitas Ni-NTA, dikarakterisasi dengan elektroforesis dan ditentukan aktivitasnya dengan metode 3,5-dinitrosalisylic acid (DNS). Proteinprotein ini telah berhasil diproduksi di Escherichia coli BL21 PlysS dan Escherichia coli BL21 CodonPlus-Ripl selama 16 ? 18 jam dengan induser isopropil ?-D-1- tiogalaktopiranosida (IPTG) 0,1 mM dan suhu inkubasi ±10°C. Berat molekul protein-protein ini adalah ~61,5 kDa yang dikarakterisasi oleh sodium dodesil sulfatgel elektroforesis poliakramid (SDS-PAGE). Protein-protein ini ada yang larut dan tidak larut (badan inklusi). Pada mutan His141Lys badan inklusi lebih dominan dibandingkan fraksi terlarut. Aktifitas spesifik protein larut BmaN2 wildtype sebesar 21,08; mutan His141K pada Escherichia coli BL21 CodonPlus-Ripl 4,28 ; dan mutan His141K pada Escherichia coli BL21 PlysS tidak memiliki aktivitas enzimatik. Hasil penelitian menunjukkan gen pengode ?-amilase BmaN2 dengan perubahan residu His141Lys berhasil diekspresikan dalam sel Escherichia coli BL21 (DE3) CodonPlus-Ripl Pada E. coli BL21 PlysS, gen pengode BmaN2/His141Lys tidak dapat diekspresikan. Massa pelet sel E. coli BL21 (DE3) CodonPlus-Ripl 0.84 gram dan E.coli BL21 PlysS 0.82 gram dengan masing-masing konsentrasi protein total terlarut 34.12 mg/mL dan 14.34 mg/mL. Selain itu, dari hasil uji kelarutan BmaN2 di Escherichia coli BL21 (DE3) CodonPlus–Ripl menunjukkan bahwa terdapat BmaN2 pada fasa debris dan lisat walaupun lebih dominan di fasa debris. Pada hasil pemurnian BmaN2 di Escherichia coli BL21 (DE3) CodonPlus-Ripl, BmaN2 terelusi pada fraksi wash 75 mM imidazole dimana ini sesuai dengan BmaN2 pada kondisi wildtype. Dengan uji kualitatif dengan metode Fuwa dapat dilihat bahwa sebelum dan sesudah pemurnian terdapat aktivitas dari enzim yang ditandai dengan memudarnya warna ungu menjadi agak bening. BmaN2 yang dihasilkan dapat diaplikasikan untuk mengetahui pola hidrolisis pati mentah.