Perpustakaan Digital ITB

Tuberkulosis merupakan penyakit mematikan yang disebabkan oleh bakteri patogen Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). Kasus meningkatnya jumlah penderita tuberkulosis pada dekade terakhir dikaitkan dengan belum jelasnya mekanisme patogenitas M. tuberculosis dan/atau munculnya galur-galur M. tuberculosis baru yang resisten terhadap obat anti tuberkulosis (OAT). Salah satu protein target untuk mempelajari mekanisme patogenitas M. tuberculosis adalah sistem PhoR-PhoP, yaitu suatu sistem tranduksi sinyal dua komponen spesifik pada M. tuberculosis dan sistem ini tidak terdapat pada eukariot (mamalia). Sistem ini sekaligus dapat dijadikan sebagai target obat untuk menanggulangi tuberkulosis. Protein domain sensor PhoR (ds-PhoR) berperan sebagai sensor sinyal untuk mengaktifkan gen-gen virulensi M. tuberculosis. Pengetahuan mengenai struktur diperlukan untuk mempelajari interaksi ds-PhoR dengan ligannya, sehingga kandidat OAT berupa inhibitor PhoR dapat ditentukan. Untuk mencapai tujuan tersebut, gen pengode ds-PhoR dalam vektor ekspresi pRSET-emGFP diekspresikan secara optimal sehingga ds-PhoR dihasilkan dalam jumlah besar, larut dalam bufer, dan murni. Pada penelitian ini ekspresi gen pengode ds-PhoR dilakukan dalam Escherichia coli BL21(DE3) dengan penambahan induser isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 0,1 mM pada suhu 20 oC selama 16 jam. Hasil ekspresi gen dapat diketahui menggunakan sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Elektroforegram SDS-PAGE menunjukkan adanya pita tebal pada ukuran ~17 kDa, sesuai ukuran PhoR yang dideduksi dari urutan nukleotida penyusun gen ds-PhoR. Namun, protein PhoR yang dihasilkan membentuk inclusion bodies (mengendap/presipitasi). Oleh karena itu, perlu dilakukan refolding (pelipatan ulang) ds-PhoR untuk mendapatkan protein yang larut dalam bufer. Endapan ds-PhoR didenaturasi dengan bufer yang mengandung urea 8 M dan selanjutnya PhoR dilipat ulang dengan mengurangi konsentrasi urea hingga 0 M. Hasil pelipatan ulang ds-PhoR kemudian dimurnikan dengan kromatografi afinitas nikel-nitroloacetic acid (Ni-NTA). Protein ds-PhoR yang terikat dengan matriks Ni-NTA kemudian dielusi dengan bufer yang mengandung gradien 50 ̶500 mM imidazol. Elektroforegram SDS-PAGE hasil pemurnian menunjukkan ds-PhoR berhasil dimurnikan dengan bufer yang mengandung 250 mM imidazol. Protein ds-PhoR murni ditandai dengan pita tunggal pada elektroforegram SDS-PAGE dan konsentrasinya adalah 1,28 mg/mL. Kebenaran protein ds-PhoR murni divalidasi dengan teknik spektroskopi massa.