Perpustakaan Digital ITB

Sistem seleksi berbasis auksotrof digunakan untuk menggantikan sistem seleksi antibiotik pada plasmid untuk produksi protein terapeutik rekombinan. Hal ini dilakukan untuk mencegah penyebaran resistensi antibiotik dan hipersensitivitas pasien. Inang yang digunakan dalam sistem seleksi berbasis auksotrof merupakan inang galur auksotrof yakni E. coli mutan gen esensial pada kromosom yang berperan dalam sintesis senyawa organik tertentu. Salah satu gen esensial yang dapat dimutasi adalah tetrahidrodipicolinat-n-suksiniltransferase (dapD). Gen ini berperan berperan dalam jalur biosintesis diaminopimelat dan asam amino lisin. Metode CRISPR-Cas9 telah dikembangkan untuk memutasi gen. Metode ini menggunakan sistem dua plasmid, yakni plasmid pCas dan pTargetT. Penelitian ini bertujuan untuk mengkonstruksi plasmid pTargetT yang membawa fragmen DNA N20 dan X1X2 yang pada penelitian selanjutnya akan digunakan untuk memutasi gen dapD pada E. coli BL21(DE3). Plasmid ini dinamakan pTargetT-dapD dan diperoleh dengan mensubstitusi bagian N20 yang mentarget cadA, sgRNA, dan, terminator sgRNA-N20 pada pTargetF Yang didapat dari Addgene. Fragmen DNA pengganti berupa fragmen DNA N20dapD-X1X2 yang terdiri dari N20 yang mentarget dapD, sgRNA, terminator, dan komponen DNA donor X1X2. Fragmen ini terinsersi pada plasmid pUC-18 serta dengan sisi pemotongan enzim SpeI dan EcoRI. Substitusi dimulai dengan memotong masing-masing plasmid dengan kedua enzim. Potongan N20dapD-X1X2 dan pTargetF (tanpa N20-cadA, sgRNA, dan terminator) yang sudah dalam bentuk linier dimurnikan dan kemudian diligasi menggunakan enzim ligase. Hasil ligasi ditransformasi ke E. coli dengan metode kejut panas. Hasil analisis lisis cepat transforman menunjukkan adanya tiga kandidat transforman. Plasmid pTargetT-dapD dari Transforman 20 dikonfirmasi kebenarannya menggunakan analisis migrasi, pemotongan, dan PCR. Hasil penentuan urutan basa mampu mengkonfirmasi 93% urutan basa fragmen N20dapD-X1X2. Dengan demikian plasmid pTargetT-dapD Telah berhasil dikonstruksi. Konfirmasi sisa 7% urutan basa fragmen N20dapD-X1X2 pada pTargetT-dapD dapat dilakukan dengan primer primer X1delEcoRI dan For-X1.