Lipase mikroba merupakan enzim yang banyak digunakan untuk keperluan komersial seperti dalam industri kimia, makanan, farmasi, deterjen dan aplikasi industri lainnya. Penelitian ini bertujuan untuk mempelajari pengaruh mutasi pada salah satu residu oxyanion hole (H110) terhadap aktivitas lipase LK_ITB5a. Berdasarkan analisis komputasi, mutasi yang dapat menghasilkan sifat lipase yang diinginkan adalah ketika H110 disubtitusi menjadi F110. Gen LK_ITB5a dan LK_ITB5a H110F telah diperoleh dengan metode Polymerase Chain Reaction. Gen mutan dan wild type telah dimasukkan ke dalam vektor ekspresi pET-30a. Ekspresi protein rekombinan dilakukan pada keadaan suhu 37⁰C, IPTG 1mM, agitasi 150 rpm dan diinkubasi selama 4 jam. Overekspresi gen lipase telah dianalisis dengan SDS-PAGE dan menghasilkan dua pita tebal protein rekombinan berukuran sekitar 36 kD dan 32 kD. Berdasarkan analisis densitrometrik menggunakan software ImageJ, lipase dengan ukuran 36 kD diekspresikan sekitar 26,4 % untuk wild type dan sekitar 23,01 % untuk mutan. Sedangkan lipase dengan ukuran 32 kD diekspresikan sekitar 14 % untuk wild type dan sekitar 14,67 % untuk mutan. Kedua pita tebal lipase wild type dan mutan telah berhasil dipurifikasi secara parsial menggunakan kromatografi affinitas Ni-NTA. Lipase LK_ITB5a wild type dan mutan memiliki jenis substrat optimum, suhu optimum dan pH optimum yang sama yaitu substrat berupa pNP-Dekanoat, suhu 40 ⁰C dan pH 9. Lipase mutan memiliki aktivitas spesifik yang lebih tinggi dibandingkan lipase wild type pada semua jenis substrat (pNP-Dekanoat, pNP-Laurat, pNP-Miristat dan pNP-Palmitat). Lipase mutan juga memiliki aktivitas spesifik lebih tinggi sekitar empat setengah kali dibandingkan lipase wild type pada suhu optimum dan pH optimum. Oleh karena itu dapat disimpulkan bahwa mutasi H110F pada lipase LK_ITB5a menyebabkan perubahan interaksi antara enzim dengan substrat sehingga dapat meningkatkan aktivitas spesifik dari enzim tersebut.