Perpustakaan Digital ITB

Interferon (IFN) merupakan suatu sitokin yang dihasilkan dan disekresikan oleh hampir semua sel eukariot sebagai respon terhadap stimulasi virus, bakteri, antigen, atau mitogen tertentu. Berdasarkan tipe reseptor yang dapat dikenali pada permukaan membran sel, IFN dikelompokkan menjadi tipe I dan II. Tipe I meliputi IFNa, IFNB, IFN t, dan IFN w. Tipe II terdiri atas IFN y. Hepatitis B dan C merupakan penyakit berbahaya karena jika tidak ditangani secara tepat dapat berkembang menjadi kanker hati. Data WHO 2002 menunjukkan angka kematian di seluruh dunia adalah 1 juta orang per tahun untuk hepatitis B dan 1,4 juta orang untuk hepatitis C. Sampai saat ini IFNa2b merupakan satu-satunya standar terapi untuk penyakit hepatitis B dan hepatitis C baik dalam monoterapi atau terapi kombinasi dengan analog nukleosida. Terapi hepatitis B menggunakan IFNa dilakukan selama 48 minggu, dan untuk hepatitis C 24 sampai 48 minggu. Harga IFNa2b sangat mahal yaitu sekitar 2,5-2,8 juta untuk dosis sekali pakai sehingga tidak semua penderita hepatitis B atau C memperoleh terapi IFNa2b. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan protein rekombinan IFNa2b melalui kloning daerah pengkode IFNa2b sintetik pada Escherichia coli (E. coli). Urutan nukleotida kerangka baca terbuka IFNa2b telah diketahui dan kodonnya telah dioptimasi untuk E. coli. Kerangka baca terbuka IFNa2b disintesis menggunakan 10 oligonukleotida dengan metode Thermodynamically Balanced Inside-Out (TBIO). Selanjutnya dilakukan amplifikasi kerangka baca terbuka sekaligus menambahkan situs pemotongan enzim yaitu EcoRI dan HindIII dengan Polymerase Chain Reaction (PCR). Kerangka baca terbuka kemudian diligasi dengan vektor kloning pGEM-T dan hasil ligasi ditransformasikan ke dalam E. coli JM109. Penentuan urutan nukleotida dilakukan untuk mengetahui urutan nukleotida kerangka baca terbuka IFNa2b pada plasmid rekombinan. Plasmid pGEM-T membawa kerangka baca terbuka IFNa2b diperoleh, namun mengandung satu mutasi delesi nukleotida deoksiguanosin monofosfat pada kodon kedua. Selanjutnya kerangka baca terbuka tersebut berhasil dipindahkan ke dalam vektor ekspresi pET32b dan hasil ligasi ditransformasikan ke dalam E. coli DH5a menghasilkan plasmid rekombinan pET32b IFNa2b G del. Perbaikan urutan nukleotida kerangka baca terbuka pET32b IFNa2b G del dilakukan dengan mutagenesis terarah. Produk mutagenesis kemudian ditransformasikan ke dalam E. coli TOP10. Plasmid pET32b IFNa2b yang telah memiliki urutan nukleotida kerangka baca terbuka IFNa2b yang benar ditransformasi ke dalam E. coli BL21. Transforman dikultur dan diinduksi dengan penambahan isopropil B-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) sehingga menghasilkan protein rekombinan IFNa2b. Protein yang dihasilkan merupakan protein fusi dengan poli histidin untuk mempermudah proses purifikasi. Protein kemudian dikarakterisasi melalui metode Sodium Deodesyl Sulphate Poly Acrylamide Gel Electrophoresis (SDS PAGE), menunjukkan pita IFNa2b rekombinan berukuran 37 kDa. Pemurnian dilakukan menggunakan kolom nikel dan protein murni dikarakterisasi dengan metode SDS PAGE dan spektrometri massa Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI TOF). Hasil karakterisasi menunjukkan bahwa protein yang dihasilkan mempunyai kemiripan yang tinggi dengan IFNa2 dimana IFNa2b adalah salah satu anggotanya.