Perpustakaan Digital ITB

Limbah plastik, khususnya polyethylene terephthalate (PET), merupakan limbah yang paling berkontribusi dalam pencemaran lingkungan akibat sifatnya yang sangat resisten terhadap degradasi alami. Enzim PETase (polietilen tereftalat hidrolase) merupakan enzim yang memiliki kemampuan untuk menghidrolisis plastik PET menjadi monomer penyusunnya, Enzim ini pertama kali ditemukan pada bakteri Ideonella sakaiensis. Salah satu penelitian yang telah dilakukan sebelumnya adalah mengekspresikan PETase mutan dalam sistem ekspresi Escherichia coli BL21 (DE3). Namun, sebagian besar protein tertahan dalam fraksi intraseluler yang tidak larut (insoluble). Oleh karena itu, pada penelitian ini mengeksplorasi sistem ekspresi alternatif, yaitu Escherichia coli strain SCM6 ?lpp, yang memiliki delesi pada gen lpp untuk meningkatkan permeabilitas membran luar untuk meningkatkan sekresi enzim ke fraksi ekstraseluler. Penelitian ini bertujuan untuk mengkonstruksi plasmid, menguji ekspresi gen PETase mutan pada E. coli SCM6 ?lpp, dan optimasi ekspresi enzim. Konstruksi plasmid ekspresi yang membawa gen PETase mutan dilakukan dengan metode Gibson Assembly, selanjutnya ditransformasikan ke E. coli TOP10 untuk amplifikasi, kemudian ke E. coli SCM6 ?lpp sebagai inang ekspresi. Keberadaan gen target PETase dikonfirmasi dengan PCR dan sekuensing DNA. Ekspresi enzim PETase mutan dianalisis menggunakan SDS-PAGE dan uji aktivitas enzim terhadap substrat p-nitrofenil butirat (PNPB). Optimasi ekspresi dilakukan terhadap konsentrasi IPTG (0; 0,25; 0,5; 1 mM) pada suhu 24 °C, dilanjutkan dengan variasi waktu inkubasi (8, 12, 18, dan 24 jam). Fraksi ekstraseluler dari kondisi terbaik kemudian dipurifikasi menggunakan kolom Ni-NTA. Aktivitas enzim hasil purifikasi diuji terhadap PET film, dan dianalisis menggunakan mikroskop elektron (SEM). Hasil dari penelitian ini, plasmid rekombinan berhasil dikonstruksi dan ditransformasikan ke E. coli SCM6 ?lpp. Optimasi konsentrasi IPTG menunjukkan bahwa 0,5 mM menghasilkan aktivitas tertinggi pada fraksi ekstraseluler dengan aktivitas 58 unit/mL enzim dan menunjukkan perbedaan signifikan dibandingkan 0 mM dan 0,25 mM (p < 0,05). Pada optimasi waktu induksi, aktivitas enzim pada 24 jam menunjukkan aktivitas tertinggi secara signifikan (p < 0,05) yaitu mencapai 78 unit/mL enzim pada fraksi ekstraseluler. Purifikasi protein menggunakan kolom Ni-NTA menunjukkan efisiensi yang rendah. Namun demikian, uji aktivitas terhadap substrat PET film menunjukkan adanya aktivitas degradasi yang jelas pada PET murni, PET crude, dan flowthrough, sedangkan kontrol negatif tidak menunjukkan aktivitas. Dapat disimpulkan bahwa penelitian ini menunjukkan E. coli SCM6 ?lpp memiliki potensi sebagai sistem ekspresi alternatif untuk produksi enzim PETase mutan, dan optimasi konsentrasi IPTG dan waktu inkubasi menghasilkan peningkatan ekspresi dan aktivitas enzim, terutama pada fraksi ekstraseluler.