Perpustakaan Digital ITB

Pati merupakan polimer karbohidrat yang tersusun atas amilosa dan amilopektin. Keduanya tersusun dari monomer berupa D-glukosa yang dihubungkan oleh ikatan ?-1,4-glikosidik dengan tambahan ikatan ?-1,6-glikosidik pada cabang amilopektin. Rasio komposisi amilosa dan amilopektin mampu mempengaruhi sifat fisikokimia dan struktur pati yang berupa semikristalin. Keberadaan amilosa mampu membentuk rongga hidrofobik dan struktur single helix menyebabkan pati sulit larut dalam air, sehingga membutuhkan proses pemanasan pada suhu tinggi (gelatinisasi) agar bisa dihidrolisis oleh enzim. Akan tetapi, tidak semua enzim memiliki stabilitas termal yang tinggi. Alternatif lain dapat dilakukan dengan penggunaan enzim yang memiliki kemampuan mendegradasi pati mentah seperti ?-amilase (Raw Starch Degrading Amylase/RSDA). RSDA biasanya memiliki domain tambahan berupa Starch Binding Domain (SBD) yang berperan dalam pengikatan pati. ?-amilase yang dihasilkan oleh Bacillus megaterium NL3 (BmaN2) memiliki kemampuan mendegradasi pati mentah walaupun tidak memiliki SBD. Pada BmaN2, ketidak tersediaan SBD dikompensasi oleh keberadaan Surface Binding Site (SBS) yang diyakini merupakan peranan dari residu His141 dan Trp198. His141 berada pada molecular tweezers yang berperan untuk mengapit karbohidrat, sedangkan Trp198 berada pada loop domain A yang merupakan pintu masuk substrat ke sisi katalisis. Penelitian ini bertujuan untuk menentukan peranan dari His141 dan Trp198 dalam proses pengikatan pati dengan pendekatan biokimia dan bioinformatika. Studi terhadap struktur dan aktivitas hidrolisis dilakukan dengan mutasi terarah terhadap BmaN2 pada residu His141 menjadi Lys141 dan Trp198 menjadi Ala198. BmaN2 wild type dan mutan rekombinan diekspresi dan diproduksi oleh sel inang Escherichia coli BL21 (DE3) pada suhu 25 oC dengan penambahan 0,1 mM Isopropil ?-D-1-Thiogalaktopiranosida (IPTG) selama 4 jam. Ekstrak kasar diperoleh dengan lisis sel inang menggunakan homogenizer dan sonikasi dalam bufer lisis (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, protease inhibitor, dan 10 mM imidazol) pH 8. Ekstrak kasar terlarut dimurnikan menggunakan metode kromatografi afinitas nikel dan kobalt dengan penambahan bufer elusi berupa bufer lisis tanpa protease yang mengandung gradien konsentrasi imidazol 50 mM, 75 mM dan 100 mM. Analisis ekspresi dilakukan dengan mengamati keberadaan pita protein BmaN2 berukuran ~61,5 kDa menunjukkan defisiensi ekspresi pada mutan H141K. Uji kelarutan menghasilkan dominasi agregasi protein pada BmaN2/H141K, hal tersebut menunjukkan mutasi H141K mampu merubah kestabilan BmaN2. Mutan W198A mengalami penurunan sebesar 52% pada aktivitas hidrolisis substrat pati terlarut dan tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan terhadap aktivitas hidrolisis pati mentah gandum dan kentang yang menunjukkan pola teratur seperti kurva Michaelis-Menten. Mutasi W198A diyakini tidak mengubah kemampuan BmaN2 untuk mengenali substrat pati mentah gandum dan kentang, tetapi mampu mengubah pengenalan substrat pati terlarut oleh BmaN2. Aktivitas hidrolisis pati oleh BmaN2 wild type dan mutan W198A dikonfirmasi dengan hasil Scanning Electron Microscope (SEM) yang menunjukkan pola degradasi pada pati mentah gandum dan kentang. Analisis bioinformatika menunjukkan keberadaan interaksi hidrofobik dengan ligan akarbosa pada kedua mutan. Kalkulasi probabilitas peranan pengikatan substrat pati hanya menunjukkan nilai yang besar pada His141. Berdasarkan kedua pendekatan tersebut, mutasi W198A diyakini menjadikan Ala198 sebagai kandidat residu substrat spesifisitas yang dapat mengenali jenis substrat tertentu, sedangkan His141 diyakini memiliki peranan besar pada pengikatan substrat. Kemampuan hidrolisis pati mentah oleh BmaN2 wild type dan mutan diharapkan dapat membuka peluang pemanfaatan BmaN2 sebagai metode alternatif yang ramah lingkungan dalam industri pati.