Perpustakaan Digital ITB

Protein disulfida isomerase (PDI, EC 5.3.4.1) yang dikode oleh gen PDII ragi S. cerevisiae merupakan katalis dalam reaksi oksidasi gugus thiol, reduksi dan isomerisasi ikatan disulfida pada molekul protein. PDI tersusun atas dua subunit. Masing-masing subunit terdiri dari domain a, b, b', a' clan c. Penelitian ini bertujuan mengkontruksi dan mengkarakterisasi mutan PDI yang tidak mengandung domain b' (pdi-Ab'). Mutan pdi-Ab' dikonstruksi dengan cara mendelesi fragmen DNA domain b' dari gen PDII ragi menggunakan metode PCR. Delesi fragmen DNA domain b' telah dilakukan melalui tiga kali tahapan PCR_ PCR pertama digunakan untuk mengamplifikasi fragmen DNA domain a'-c (± 447 pb). Ujung 3' fragmen DNA hasil PCR pertama mempunyai beberapa nukleotida yang dapat membentuk pasangan komplemen dengan nukleotida ujung 5' dari domain b'. Fragmen DNA ± 447 pb selanjutnya digunakan sebagai primer untuk menghasilkan fragmen DNA ± 1190 pb bersama primer lain dalam PCR kedua. I'CR ketiga dilakukan untuk mengoptimumkan fragmen DNA ± 1190 pb hasil PCR kedua. Fragmen DNA ± 1190 pb ini sesuai untuk fragmen DNA domain a-b-a'-c. Fragmen DNA ± 1190 pb hasil PCR disubkloning menggunakan vektor pGemT. Rekombinan pGem T- pdiI-Ab' kemudian dipotong dengan enzim restriksi NdeI clan BamHl. Fragmen DNA ± 1190 pb hasil pemotongan oleh enzim NdeI clan BaniHI disubkloning vektor ekspresi E. coli, pT 7.7. Urutan nukleotida fragmen DNA ± 1 190 pb yang telah dianalisis dengan metode dideoksi menunjukkan tidak adanya mutasi pada fragmen DNA ± 1190 pb. Ekspresi mutan pdil-Ab' menghasilkan protein dengan berat molekul ± 45 kDa, sementara PDI wild type mempunyai berat molekul ± 60 kDa. Mutan pdi-Ab' mempunyai aktivitas mereduksi ikatan disulfida insulin sebesar 52 dari wild type-nya. Delesi domain b' menurunkan kooperatilitas diantara domain-domain lain PDI dalam mengikat substrat. Domain b' diduga berperan penting untuk afinitas pengikatan substrat. Mutan pdi-Ab'bersifat lebih sensitif terhadap proteinase K. Gejala ini menunjukkan bahwa mutan pdi-Ab' mungkin mempunyai stabilitas konformasi yang berbeda dari PDI wild type.