Perpustakaan Digital ITB

Berbagai DNA polimerase termostabil komersial yang ada saat ini mempunyai karakteristik yang berbeda-beda. Dengan demikian masih diperlukan penelitian mengenai karakteristik DNA polimerase termostabil yang dihasilkan oleh organisme termofilik lain. Coding sequence (CDS) utuh gen DNA polimerase dari bakteri termofilik isolat Cimanggu (pH 5, 70°C) yang kekerabatannya paling dekat dengan Bacillus thermoleovorans telah diklon dan ditentukan urutan nukleotidanya. Studi mengenai hubungan struktur dan fungsi DNA Polimerase termostabil bakteri isolat Cimanggu memerlukan berbagai enzim mutan. Pada penelitian ini telah dilakukan konstruksi berbagai gen mutan delesi (∆) dengan cara delesi in frame menggunakan enzim restriksi. Selanjutnya dilakukan konstruksi gen mutan A di vektor ekspresi pTrxFus untuk ekspresi tinggi. Ekspresi gen dilakukan dengan cara menginduksi sel transforman dengan triptofan. Identifikasi gen DNA polimerase mutan ∆ dilakukan melalui analis restriksi dan sekuensing. Karakterisasi DNA Polimerase Mutan ∆ dilakukan dengan SDS-PAGE dan uji aktivitas polimerase. Uji aktivitas polimerase dilakukan dengan teknik ELISA sandwich secara non radioaktif. Konstruksi gen DNA polimerase mutan ∆EcoRl, mutan ∆XhoI, mutan ∆Rsal dan mutan ganda ∆XhoI-EcoRV telah berhasil dilakukan. Mutan ∆EcoRl kehilangan salah satu anggota carboxylate triad yaitu Asp653; mutan ∆Xhol kehilangan domain eksonuklease 5'-3' hingga domain eksonuklease 3'-5' dan ; mutan ∆Rsal kehilangan domain eksonuklease 5'-3' atau N-terminal domain. Uji aktivitas protein ekstrak kasar DNA Polimerase mutan ∆EcoRl (89 kDa) hasil ekspresi tinggi secara kualitatif menunjukkan bahwa aktivitasnya hilang (99,9%) bila dibandingkan dengan enzim wild type. Gen DNA polimerase mutan ∆Xhol tidak berhasil diekspresikan meskipun plasmid tetap stabil selama proses ekspresi dan hasil sekuensing mengkonfirmasikan bahwa gen mutan ∆Xhol adalah in frame.