Perpustakaan Digital ITB

Katalase (EC 1.11.1.6) berperan dalam pemecahan hidrogen peroksida yang toksik menjadi molekul oksigen dan air yang bersifat stabil dan nontoksik bagi sel. Secara komersial, katalase dimanfaatkan untuk mengeliminasi hidrogen peroksida pada industri makanan, tekstil, kedokteran, terapeutik, kosmetik, dan pengolahan limbah. Hal tersebut menyebabkan permintaan enzim ini menjadi tinggi dengan peningkatan 3,2% sejak 2023. Penggunaan enzim di dalam negeri saat ini hampir seluruhnya diimpor dari Cina, India, Jepang, dan Eropa, sehingga menjadi relatif mahal. Dunia industri membutuhkan katalase yang stabil pada pH 9-11 dan suhu 40-60°C. Katalase komersial umumnya aktif pada 20-50°C dan pH netral, sehingga memiliki keterbatasan dalam pemanfaatannya. Oleh karena itu, diperlukan sumber katalase alternatif untuk memenuhi kebutuhan dunia industri, salah satunya dari mikroba. Tujuan penelitian ini adalah memproduksi dan mengkarakterisasi katalase hidroperoksidase II rekombinan Staphylococcus equorum (rHPIISeq). Katalase ini belum pernah diteliti sebelumnya. Metode yang digunakan yaitu teknologi DNA rekombinan. Urutan gen hpII dioptimasi untuk menyesuaikan preferensi kodon sel inang Escherichia coli BL21(DE3). Nilai persen basa guanin dan sitosin (GC) serta codon adaptation index (CAI) hasil optimasi dianalisis secara in silico dengan menggunakan perangkat lunak GenScript (https://www.genscript.com/tools/rarecodon-analysis). Urutan gen hasil optimasi (hpII gene-opt) kemudian disintesis dan diklon ke vektor ekspresi pET-15b secara komersial. Dari tahapan ini dihasilkan plasmid rekombinan pET-15bHPIISeq. Selanjutnya plasmid tersebut ditransformasikan ke sel inang E. coli BL21(DE3) untuk mendapatkan enzim rHPIISeq. Ekspresi gen sintetik pengkode rHPIISeq di E. coli BL21(DE3) didominasi oleh bentuk tidak terlarut badan inklusi (BI) sebanyak >90%. Upaya peningkatan rHPIISeq terlarut dilakukan secara in vivo dan in vitro. Optimasi in vivo dilakukan dengan membuat variasi konsentrasi isopropil ?-D-1-tiogalaktopiranosida (IPTG) (0,1-1 mM), suhu, dan waktu overproduksi (25 dan 37°C; 5 dan 20 jam). Optimasi in vivo juga dilakukan dengan penambahan L-arginin 0,5% dan D-glukosa 0,5% ke media overproduksi, serta ko-ekspresi chaperon. Chaperon yang digunakan dalam penelitian ini adalah GroES/EL-TF (plasmid pG-Tf2), GroES/EL (plasmid pGro7), dan kombinasi DnaK-DnaJ-GrpE-GroES/EL (plasmid pG-KJE8). Optimasi in vitro dilakukan dengan solubilisasi fraksi BI rHPIISeq menggunakan urea (2-8 M). Hasil solubilisasi kemudian direnaturasi (refolding) dengan gradasi penurunan konsentrasi urea. Pemurnian rHPIISeq terlarut dilakukan dengan beberapa metode, yaitu kromatografi afinitas Ni-NTA, kromatografi penukar ion, filtrasi gel, dan presipitasi amonium sulfat yang dilanjutkan dengan dialisis. Aktivitas katalase rHPIISeq diuji secara kualitatif dan kuantitatif. Pengujian kualitatif dilakukan dengan uji gelembung dan zimografi. Pengujian kuantitatif dilakukan dengan metode kolorimetri menggunakan spektrofotometer UV- Vis. Hidrogen peroksida mengoksidasi kobal (II) menjadi kobal (III) dan reaksi diakhiri dengan pembentukan kompleks karbonat-kobaltat (III). Aktivitas dihitung berdasarkan penurunan absorbansi ketika katalase memecah hidrogen peroksida pada panjang gelombang 440 nm. Aktivitas dan stabilitas rHPIISeq juga dipelajari pada berbagai pH dan suhu. Hasil optimasi gen sintetik hpII meningkatkan kandungan GC (dari 37,6 menjadi 51,4%) dan CAI (dari 0,650 menjadi 0,813). Gen ini memiliki ukuran 1989 pb dan mengkode 663 asam amino. rHPIISeq mengalami penambahan 20 asam amino dibandingkan bentuk alaminya, dengan ukuran teoritis 77,5 kDa. Kondisi optimum overproduksi rHPIISeq terlarut dan aktif yaitu pada 25°C selama 20 jam dengan induksi IPTG 0,5 mM. Dari 1 L kultur dihasilkan berat basah sel 1,52 ± 0,18 g yang mangandung protein intrasel total terlarut 394,47 mg/L. Berdasarkan intensitas pita protein ukuran 75,22 kDa pada gel SDS-PAGE, terdapat ~2,46% (9,73 ± 1,17 mg /L) rHPIISeq pada protein total tersebut. rHPIISeq termasuk katalase monofungsional subunit besar jika dilihat dari ukuran monomernya. Pada umumnya kelompok katalase ini memiliki struktur homo tetramer. Namun pada penelitian ini belum dibuktikan. Upaya peningkatan kelarutan rHPIISeq in vivo menggunakan ko-ekspresi chaperon belum berhasil. Solubilisasi BI secara in vitro berhasil dilakukan menggunakan urea 4 M. Namun, pada tahapan refolding, BI kembali terbentuk. Untuk penelitian ini, pemurnian rHPIISeq berhasil dilakukan secara parsial menggunakan metode presipitasi amonium sulfat 40% dan dialisis, dengan tingkat kemurnian 26,26 kali. Hasil pemurnian ini memberikan aktivitas positif pada uji gelembung dan kolorimetri kompleks karbonat-kobaltat (III). Katalase rHPIISeq hasil presipitasi memiliki aktivitas spesifik 3 x 10 6 ± 1,58 U/mg (dengan katalase hati sapi sebagai pembanding) dan yield 2,19%. rHPIISeq memiliki aktivitas optimum pada pH 7 dan suhu 37ºC. Enzim ini stabil pada pH 7-10 dan suhu 20-50ºC. Berdasarkan karakteristiknya, enzim rekombinan ini dapat digolongkan sebagai katalase alkali mesofilik. Dengan karakter tersebut, rHPIISeq berpotensi untuk digunakan dalam aplikasi industri, khususnya yang membutuhkan kondisi basa dengan suhu relatif dingin hingga sedang.