Perpustakaan Digital ITB

Reverse transcriptase (RT) merupakan enzim yang berperan dalam mengkatalis reaksi konversi RNA menjadi complementary DNA (cDNA). Pada penelitian sebelumnya telahdilakukan pengembangan enzim rekombinan RT dengan menggunakan sistemekspresi bakteri E. coli BL21 dalam medium Luria Bertani (LB). Namun, hasil tersebut dianggapbelum optimal karena penggunan media LB dinilai kurang efisien secara ekonomi dansebagian besar protein diekspresikan pada inclusion body. Sehingga penelitianini bertujuan untuk mengevaluasi penggunaan molase tebu yang diberi perlakuan invertase(Invertase Treated Molasses, ITM) sebagai sumber karbon alternatif dalamproduksi enzim RT rekombinan. Pada penelitian ini, Sumber karbon molase diberi perlakuaninvertase selama 24 jam pada suhu 50 oC, selanjutnya, komponen gula dikuantifikasi dengan metode HPLC. Transformasi plasmid yang berisi gen pengkode enzimRTdilakukan pada sel E. coli DH5? dan E. coli BL21 (DE3), keberhasilan transformasi dikonfirmasi menggunakan metode PCR koloni. Keberhasilan dari ekspresi enzimRTrekombinan dikonfirmasi menggunakan metode SDS-PAGE. Berikutnya dilakukanpembuatan kurva standar E. coli BL21 (DE3) menggunakan suspensi sel yang berasal dari kultur padat yang telah diinkubasi overnight pada suhu 37 oC. Dilanjutkan denganpembuatan kurva tumbuh pada media minimal dengan variasi konsentrasi ITM(1%dan2%) dan konsentrasi garam (1 dan ½). Media dengan kinetika pertumbuhan terbaikdilanjutkan sebagai media produksi pada suhu 25 oC dan 37 oC dengan (A) dan tanpaaktivasi (TA). Analisis ekspresi protein dilakukan dengan metode SDS-PAGEdenganbantuan software ImageJ. Uji aktivitas dilakukan menggunakan metode two step RT- qPCR dengan membandingkan nilai Ct perlakuan terhadap nilai Ct RT komersial (?Ct). Pada hasil PCR koloni diperoleh pita DNA berukuran ~2.5 kb dan konfirmasi ekspresi diperoleh pita protein berukuran ~82 kDA. Hasil HPLC menunjukkan terjadi peningkatankonsentrasi fruktosa dan glukosa sebesar 137% dan 158% serta penurunan konsentrasi sukrosa sebesar 75% pada molase dengan perlakuan invertase jika dibandingkan denganmolase tanpa perlakuan invertase. Secara keseluruhan laju pertumbunan pada keempat variasi media molase jika dibandingkan dengan LB secara statistik tidak menunjukkanperbedaan yang signifikan. Kinetika pertumbuhan terbaik ditunjukkan oleh variasi medium 1,1 dan 1,½ dengan laju pertumbuhan (µ) 0.537 dan 0.542 jam-1 tanpa adanyafase lag di awal pertumbuhan. Berdasarkan hasil analisis ekspresi, protein RTdengantingkat ekspresi tertinggi pada media ITM diperoleh pada variasi 1,1 yang diinkubasi pada suhu 37°C dengan perlakuan aktivasi (1,1-37A). Hasil ini sejalan dengan hasil uji aktivitas, variasi ini memiliki rata-rata ?Ct paling rendah yaitu 2.56. Oleh karena itudapat disimpulkan molase yang diberi perlakuan invertase dapat digunakan sebagai sumber karbon dalam produksi enzim RT rekombinan tetapi perlu dioptimasi lebih lanjut. Saran untuk penelitian selanjutnya adalah penggunaan metode RSM(Response SurfaceMethodology) untuk mengoptimasi komponen media dan scale-up produksi ke volumeyang lebih tinggi.