Perpustakaan Digital ITB

Kanker merupakan salah satu penyebab kematian utama dan bertanggungjawab terhadap 21% dari total kematian global. Kanker payudara menempati urutan teratas sebagai jenis kanker paling sering didiagnosis dan penyebab utama kematian akibat kanker pada wanita. Subtipe kanker payudara positif HER2 (+HER2) dikenal bersifat agresif dengan prognosis yang buruk, terutama akibat peningkatan ekspresi protein HER2 hingga seratus kali lipat dari sel normal. Walaupun terdapat terapi berbasis antibodi monoklonal seperti trastuzumab, resistensi terhadap terapi tersebut masih sering terjadi akibat variasi struktural protein HER2, termasuk varian p95HER2 dan splice variant HER2?16 yang dapat tetap mengaktifkan sinyal onkogenik meskipun domain ekstraselulernya dihambat. Oleh karena itu, pendekatan yang menargetkan gen ERBB2 langsung pada tingkat genom diperlukan untuk menekan ekspresi dan fungsi HER2 secara lebih efektif. Perkembangan teknologi pengeditan genom berbasis CRISPR/Cas9 membuka peluang baru dalam manipulasi ekspresi gen secara spesifik, termasuk inaktivasi gen pengkode protein melalui pemotongan DNA terarah. Pendekatan ini berpotensi menjadi strategi alternatif untuk menekan ekspresi berlebih gen ERBB2/HER2, yang berperan penting dalam patogenesis berbagai kanker, khususnya kanker payudara HER2-positif. Namun, tantangan utama dari sistem CRISPR/Cas9 adalah memastikan spesifisitas dan efisiensi single-guide RNA (sgRNA) dalam memandu enzim Cas9 menuju lokasi target genom yang tepat. Penelitian ini bertujuan untuk merancang dan memvalidasi sgRNA yang menargetkan domain transmembran gen ERBB2 menggunakan sistem CRISPR/Cas9 berbasis kompleks ribonukleoprotein (RNP) antara sgRNA dan protein Cas9. Desain spacer dilakukan menggunakan tiga platform berbasis web, yaitu CHOPCHOP, CRISPOR, dan CRISPR RGEN. Spacer terpilih memiliki kandungan GC sebesar 50% pada strand positif, skor spesifisitas MIT dan CFD masing-masing 96, serta skor efisiensi on-target (berdasarkan algoritma Doench’16, Moreno-Mateos, dan Doench RuleSet3) dalam kisaran moderat hingga tinggi, skor out-of-frame 41 dan skor Lindel 78 yang menunjukkan potensi mutasi frameshift, skor self-complementarity 0, serta tidak terdeteksi off-target hingga toleransi tiga basa nukleotida. Analisis struktur sekunder sgRNA menggunakan RNAfold memperlihatkan keberadaan elemen-elemen fungsional penting repeat-anti-repeat duplex, stem-loop 2, dan stem-loop 3 yang mendukung interaksi stabil dengan Cas9. Hasil Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) memperlihatkan mobilitas kompleks sgRNA-Cas9 yang lebih lambat dibanding sgRNA bebas, menandakan terbentuknya interaksi RNP yang stabil. Aktivitas pemotongan kompleks RNP-Cas9 terhadap sekuens target dievaluasi menggunakan elektroforesis gel agarosa berdasarkan terbentuknya pita fragmen berukuran kurang dari 300 bp atau lebih kecil dibandingkan pita DNA target, mengindikasikan adanya pemotongan spesifik. Berdasarkan prediksi in silico, pemotongan menghasilkan dua fragmen berukuran 266 bp dan 257 bp. Perbedaan panjang kedua fragmen yang hanya 9 bp menyebabkan keduanya sulit dipisahkan secara jelas pada gel agarosa dan bermigrasi pada posisi yang hampir identik, sehingga tampak sebagai satu pita di bawah pita amplikon utuh. Hasil tersebut menunjukkan bahwa sgRNA yang dikembangkan mampu mengarahkan Cas9 untuk memotong gen target secara spesifik. Keberhasilan pemotongan spesifik ini menunjukkan bahwa desain sgRNA yang dikembangkan efektif dalam mengarahkan aktivitas nuklease Cas9 secara presisi terhadap gen ERBB2. Dengan demikian, rancangan ini berpotensi dikembangkan sebagai kandidat untuk terapi gen berbasis pengeditan genom dalam menekan ekspresi gen onkogenik HER2 pada sel kanker payudara +HER2. Temuan ini memberikan dasar awal dalam pengembangan terapi presisi berbasis CRISPR/Cas9 di bidang onkologi molekuler.