Perpustakaan Digital ITB

Ekpresi protein ERBB2 yang berlebih merupakan salah satu pemicu kanker payudara agresif melalui aktivasi jalur MAPK dan PI3K/Akt. Meskipun terapi anti-HER2 telah dikembangkan, resistansi dan kekambuhan masih menjadi kendala sehingga diperlukan pendekatan yang lebih spesifik dan presisi. Teknologi CRISPR-Cas9 menawarkan strategi menjanjikan untuk menonaktifkan gen penyebab kanker secara terarah. Penelitian ini bertujuan untuk mendesain gRNA spesifik terhadap domain kinase gen ERBB2 serta menentukan efisiensi pemotongan kompleks CRISPR-Cas9 RNP terhadap domain tersebut secara in vitro. Pada penelitian ini dirancang sgRNAexon25, yang menargetkan exon 25 pengkode domain kinase ERBB2, dan menguji aktivitas pemotongannya secara in vitro. Validasi in vitro sangat perlu dilakukan untuk menilai efisiensi sgRNA. Fragmen exon 25 sepanjang 933 bp berhasil diamplifikasi dari sel SKOV3 dan digunakan sebagai target uji. Desain sgRNA dengan menggunakan program CHOPCHOP menghasilkan sgRNA dengan GC 60% dan efisiensi prediksi 69,79%, sementara analisis RNAfold menunjukkan tiga stem-loop stabil yang penting bagi pengikatan Cas9. Berdasarkan hasil Electrophoretic Mobility Shift Assay EMSA, Cas9 mampu mengenali dan mengikat sgRNAexon25, yang ditunjukkan oleh pergeseran mobilitas elektroforetik sebagai indikasi terbentuknya kompleks RNP. Uji endonuklease kompleks Cas9-RNP menunjukkan bahwa kontrol positif (sgRNA196) berhasil memotong target, tetapi sgRNAexon25 tidak menunjukkan pemotongan. Hal ini kemungkinan dipengaruhi oleh tingginya GC pada wilayah PAM-proximal, penggunaan PAM CGG yang kurang optimal, serta potensi misfolding sgRNA. Dapat disimpulkan bahwa sgRNAexon25 berhasil dirancang dan mampu membentuk kompleks RNP dengan Cas9 (dibuktikan melalui EMSA).