Berdasarkan data British Petroleum, sepanjang tahun 2022 Indonesia memproduksi minyak bumi sebanyak 31.4 juta ton, sementara konsumsi minyak bumi mencapai 69.7 juta ton. Oleh karena itu, produksi minyak bumi di Indonesia perlu ditingkatkan untuk mengurangi ketergantungan impor minyak bumi. Salah satu cara untuk meningkatkan produksi minyak bumi adalah dengan Microbial Enhanced Oil Recovery (MEOR). Biostimulasi dalam proses MEOR merupakan tindakan menambahkan nutrisi, seperti karbon (C), nitrogen (N), dan fosfor (P) untuk menstimulasi pertumbuhan mikroba indigen. Mikroba indigen akan memproduksi metabolit di dalam reservoir yang akan meningkatkan kualitas karakteristik fisikokimia minyak bumi untuk meningkatkan produksi minyak ke permukaan. Penelitian ini bertujuan untuk mengoptimasi kualitas fisikokimia sumur minyak bumi di Jambi melalui optimasi nutrisi media dengan metode respons permukaan (RSM). Formulasi medium terdiri dari beberapa nutrisi seperti: molase (sumber C), NPK (sumber N dan P), dan DAP (sumber N dan P) untuk menstimulasi pertumbuhan mikroba indigen dalam reservoir. Percobaan laboratorium dilakukan dengan mengamati jumlah total bakteri dengan metode Total Plate Count (TPC) pada Nutrient Agar (NA), perubahan pH, dan perubahan indeks emulsifikasi (E24) pada perlakuan selama 5 hari masa inkubasi. Berdasarkan hasil RSM, konsentrasi nutrisi optimum yang dapat meningkatkan jumlah sel dan meningkatkan E24 adalah molase 2.29% (w/v), NPK 0.5% (w/v), dan DAP 0.19% (w/v) dengan prediksi jumlah sel sebanyak 1.88 x 108 CFU/mL, pH 6.89, dan E24 65%. Setelah dilakukan uji validasi, dicapai jumlah sel sebanyak 3.42 x 108 CFU/mL, pH 6.89, dan E24 92.45% yang sesuai dengan prediksi. Tegangan antarmuka (IFT) diukur pada hari ke-0 yaitu 34.32 dyne/cm, menurun pada hari ke-5 menjadi 32.12 dyne/cm. Komposisi fraksi minyak bumi sebelum dan sesudah perlakuan dianalisis melalui uji SARA dengan kromatografi kolom dimana konsentrasi hidrokarbon saturates meningkat dari 33.88% menjadi 44.08%, aromatics menurun dari 39.44% menjadi 33.06%, resins menurun dari 25.27% menjadi 22.04%, dan asphaltenes menurun dari 1.38% menjadi 0.82%. Hal ini didukung dengan penurunan viskositas dari 8.87 cP menjadi 0.95 cP. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa formulasi medium dengan menambahkan kosentrasi molase 2.29% (w/v), NPK 0.5% (w/v), dan DAP 0.19% (w/v) berpotensi untuk aplikasi MEOR pada sumur minyak bumi di Jambi.