Titik kritis kehalalan enzim sangat bergantung pada sumber perolehan enzim. Sumber perolehan enzim yang dapat dipastikan kehalalannya berasal dari tanaman. Protease sangat dibutuhkan dalam berbagai industri salah satunya industri pengolahan susu karena fungsinya yang mampu memecah protein menjadi oligopeptida dan asam amino. Protease dapat ditemukan di berbagai bagian tanaman seperti akar, buah, batang, kulit, dan lateks. Namun, banyak bagian tanaman yang belum dilaporkan proteasenya, termasuk inti batang pisang yang umumnya ditebang setelah masa panen dan menjadi limbah. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan untuk menginvestigasi pemanfaatan limbah inti batang pisang sebagai sumber protease halal dan potensinya sebagai enzim penggumpal susu. Dengan mengekstraksi, memurnikan, mengkarakterisasi, dan menentukan rasio aktivitas penggumpalan susu terhadap aktivitas protease (MCA/PA) dari protease limbah inti batang pisang. Ekstrak kasar protease limbah inti batang pisang (EKP) yang diperoleh melalui ekstraksi menggunakan larutan buffer pH 8,0 dipilih dalam penelitian ini. Kandungan protein total dan aktivitas spesifik protease dari EKP diperoleh masing-masing sebesar 16,7 mg dan 0,19 U/mg. Analisis elektroforesis menggunakan SDS-PAGE pada EKP menunjukkan pita dengan perkiraan berat molekul protease sebesar ~30 kDa. Pemurnian EKP menggunakan metode Three-phase Partitioning (TPP) dilakukan pada kondisi optimum amonium sulfat dengan tingkat saturasi 50% (b/v), pH campuran 6,0, dan perbandingan EKP: t-butanol, 1,0:1,25. Fraksi antarmuka (FAM) hasil pemurnian dengan sistem TPP tersebut menunjukkan aktivitas spesifik protease sebesar 0,66 U/mg dengan 3,59 kali lipat pemurnian dan pemulihan aktivitas protease sebesar 187,5%. FAM dapat berfungsi aktif pada rentang pH 4,0–7,0 dan temperatur 30–60°C, dengan pH dan suhu optimum masing-masing pada pH 6,0 dan temperatur 40°C. Lebih lanjut, rasio MCA/PA dari FAM diperoleh sebesar 60. Penelitian ini menunjukkan bahwa limbah inti batang pisang dapat dimanfaatkan sebagai sumber protease halal dan proteasenya berpotensi digunakan sebagai enzim penggumpal susu dalam produksi keju.