Perpustakaan Digital ITB

PET (Polyethylene terephthalate) merupakan salah satu jenis plastik yang paling banyak digunakan dalam kehidupan sehari-hari. Akan tetapi, PET sulit terurai, sehingga mengakibatkan penumpukkan sampah plastik di lingkungan. Pada tahun 2016, ditemukan PETase yang diisolasi dari bakteri Ideonella sakaiensis yang berada di alam. Namun, enzim ini bersifat termolabil, sehingga pada penelitian sebelumnya telah dilakukan mutasi secara in silico dan dihasilkan PETase.mutan yang termostabil. Optimasi ekspresi PETase mutan telah dilakukan pada E. coli BL21 (DE3), tetapi ekspresi protein tertinggi masih terdapat pada fraksi intraseluler insoluble. Oleh karena itu, pada penelitian ini akan dilakukan ekspresi PETase mutan pada E. coli Origami B (DE3) dengan optimasi waktu induksi yang diharapkan mampu meningkatkan ekspresi protein pada fraksi ekstraseluler. Plasmid pET 22b(+) yang mengandung gen PETase mutan diisolasi, lalu ditransformasikan pada E. coli Origami B (DE3), dan dikonfirmasi keberhasilannya dengan PCR koloni serta sekuensing DNA. Selanjutnya, dibuat kurva tumbuh dari bakteri rekombinan selama 16 jam. PETase mutan kemudian diekspresikan pada fase mid log, suhu induksi 24oC, dan konsentrasi IPTG 0,5 mM dengan variasi waktu induksi 12, 18, dan 24 jam. Pengujian dilakukan sebanyak tiga pengulangan pada tiga fraksi protein yaitu ekstraseluler, intraseluler soluble, dan intraseluler insoluble. Setelah diinduksi, dilakukan analisis protein dengan metoda SDS-PAGE dan uji aktivitas secara kolorimetri menggunakan substrat pNPB. Hasil transformasi telah terkonfirmasi melalui PCR koloni dan sekuensing DNA. Dari hasil SDS-PAGE, pita protein dengan intensitas warna paling tinggi dihasilkan oleh E. coli Origami B (DE3) pada fraksi intraseluler insoluble dengan waktu induksi 18 jam. Aktivitas PETase mutan berbeda signifikan (p<0,05) pada E. coli BL21 (DE3) dan E. coli Origami B (DE3) dengan waktu induksi 12 jam pada fraksi soluble, 18 jam pada fraksi ekstraseluler, dan 24 jam pada seluruh fraksi. Pada E. coli Origami B (DE3), variasi waktu induksi berpengaruh signifikan (p<0,05) terhadap aktivitas PETase mutan untuk seluruh fraksi protein. Aktivitas tertinggi diperoleh pada fraksi intraseluler tidak terlarut pada waktu induksi 18 jam. Kesimpulannya, E. coli Origami B (DE3) mampu mengekspresikan enzim rekombinan PETase mutan serta meningkatkan ekspresi protein fraksi ekstraseluler, dengan tingkat ekspresi dan aktivitas yang paling tinggi didapatkan pada fraksi instraseluler insoluble. Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk mengkarakterisasi enzim rekombinan PETase yang telah dihasilkan.