Perpustakaan Digital ITB

E. coli merupakan mikroba yang telah banyak dipelajari dan dimanfaatkan untuk produksi protein rekombinan karena pertumbuhannya yang cepat serta mudah untuk direkayasa. Kekurangan yang dimiliki oleh E. coli dalam memproduksi protein rekombinan adalah tidak menyekresikannya. Protein rekombinan yang disekresikan ke luar sel memberikan beberapa keunggulan, seperti kemurnian protein yang lebih baik, penyederhanaan tahapan hilir, hingga penghematan biaya. Untuk meningkatkan laju sekresi protein dari periplasma ke luar sel, salah satu rekayasa yang dapat dilakukan adalah dengan mengganggu integritas membran luar sel secara permanen melalui pembuatan leaky strain. Leaky strain dapat dibuat dengan mutasi lpp, satu-satunya protein struktural membran luar E. coli yang berikatan secara kovalen dengan peptidoglikan. Mutasi lpp dilakukan melalui genome engineering, dengan salah satu yang telah umum diaplikasikan pada prokariot karena tahapan yang sederhana dan efisiensi hasil yang tinggi adalah lambda-red recombineering. Metode ini memanfaatkan enzim lambda-red rekombinase untuk memfasilitasi terjadinya insersi fragmen DNA asing (fragmen cassette knock-out/KO) ke dalam genom target melalui adanya daerah yang homolog (homologous arm). Diawali dengan transformasi pSIM18 pada kultur E. coli agar kultur dapat mengekspresikan lambda-red rekombinase. Selanjutnya dilakukan konstruksi plasmid pembawa template cassette knock-out dengan gen penanda resistensi antibiotik kanamisin, pKIKO-Kan. Dilakukan produksi fragmen cassette KO dari plasmid tersebut menggunakan extended primer yang membawa segmen homologous arm (HA) dari gen lpp untuk proses integrasi ke genom. Dilakukan elektroporasi pada fragmen cassette KO lpp yang telah dibuat ke dalam E. coli sebanyak 6 ?g/mL (300 ng DNA/50 uL sel elektrokompeten) pada 1.8 kV, 200 ?, dan 25?F. Koloni yang berhasil tumbuh pada plate agar + Kan mengindikasikan cassette KO lpp telah terintegrasi dan meng-knock-out gen lpp pada genom target. Pada koloni tersebut dilakukan konfirmasi lanjutan melalui PCR koloni dan sequencing. Didapat koloni pada plate agar + Kan yang melalui PCR koloni serta sequencing terkonfirmasi merupakan engineered strain E. coli (?lpp).