Perpustakaan Digital ITB

Insulin adalah suatu hormon peptida yang digunakan untuk terapi diabetes. Insulin terdiri atas dua rantai peptida (A dan B) yang dihubungkan dengan dua ikatan disulfida antar rantai dan satu ikatan disulfida dalam rantai A. Insulin telah banyak dimodifikasi menjadi insulin analog untuk mendapatkan efek yang sesuai kebutuhan terapi. Salah satu insulin analog yang banyak digunakan untuk terapi diabetes di Indonesia adalah insulin Aspart. Insulin Aspart adalah insulin analog kerja cepat yang diperoleh dengan mensubtitusi asam amino prolin pada B28 menjadi asam aspartat. Modifikasi ini meningkatkan gaya tolak menolak antar rantai insulin sehingga menghambat pembentukan dimer dan akan mempercepat absorpsi insulin. Insulin utamanya diproduksi dalam bentuk proinsulin, yaitu rantai B dihubungkan dengan suatu linker peptida dengan rantai A. Keberhasilan produksi proinsulin ekstraseluler di Pichia pastoris dipengaruhi oleh banyak faktor, yaitu: efisiensi sekresi yang ditentukan oleh signal peptida, desain proinsulin yang melibatkan penggunaan linker, kondisi produksi, dan variasi galur P. pastoris. Signal peptida ?-MF yang berasal dari Saccharomyces cerevisiae adalah signal peptida yang banyak digunakan untuk mensekresikan proinsulin pada P. pastoris. Signal peptida ini memiliki spacer EAEA yang menghubungkan signal peptida dengan proinsulin. Namun, sekresi proinsulin menggunakan signal peptida ?-MF memiliki kelemahan, yaitu tidak sempurnanya pemotongan spacer EAEA sehingga dihasilkan campuran proinsulin dengan penambahan asam amino pada ujung-N. Sementara itu, delesi spacer ini menyebabkan penurunan ekspresi hingga 54%. Penggunaan spacer EEAEAEAEPK menggantikan spacer EAEA dapat meningkatkan produksi proinsulin di P. pastoris. Akan tetapi, spacer EEAEAEAEPK didegradasi sebagian oleh yeast aspartyl protease 3 menghasilkan campuran proinsulin dengan massa molekul yang bervariasi. Selanjutnya, pemilihan linker dalam desain proinsulin dapat mempengaruhi tingkat ekspresi proinsulin. Linker yang paling banyak digunakan dalam desain proinsulin adalah AAK dan RWR. Faktor-faktor produksi seperti konsentrasi metanol untuk induksi, kerapatan sel, dan aerasi; penting untuk ditentukan agar diperoleh kondisi optimum untuk memproduksi proinsulin. Selain itu, variasi galur P. pastoris dengan fenotipe yang berbeda dapat menghasilkan proinsulin dengan tingkat produksi yang berlainan. Tujuan penelitian ini adalah mempelajari pengaruh signal peptida ?-MF tanpa spacer dan dengan spacer EEAEAEAEPK terhadap tingkat sekresi proinsulin Aspart dengan linker RWR dan AAK; menentukan kondisi optimum produksi dan variasi galur untuk menghasilkan proinsulin terbaik; serta mengkarakterisasi proinsulin. Penelitian dibagi menjadi tiga tahap, tahap pertama, mempelajari tingkat sekresi proinsulin dengan dua variasi linker AAK dan RWR pada P. pastoris menggunakan signal peptida ?-MF tanpa spacer dan dengan spacer EEAEAEAEPK. Tahap kedua adalah mengkaji faktor-faktor yang mempengaruhi produksi proinsulin Aspart yang meliputi konsentrasi metanol, aerasi, kerapatan sel, dan variasi galur. Tahap ketiga adalah mengkarakterisasi proinsulin Aspart, meliputi bobot molekul, bentuk terglikosilasi, dan ikatan disulfida. Karakterisasi dilakukan dengan metode RP-HPLC, LC-MS/MS, dan ESI-MS. Proinsulin Aspart dengan linker RWR berhasil disekresikan menggunakan signal peptida ?-MF tanpa spacer. Sementara itu, penggunaan signal peptida ?-MF dengan spacer EEAEAEAEPK dan linker AAK tidak meningkatan hasil sekresi. Analisis Western Blot dan ESI-MS menunjukkan adanya satu jenis proinsulin Aspart berukuran 6,3 kDa pada ekstrasel dan tidak ditemukan di intrasel. Hasil ini mengindikasikan bahwa pemotongan signal peptida dari proinsulin tidak dipengaruhi oleh keberadaan spacer. Oleh karena itu, spacer tidak memiliki peran yang signifikan pada sekresi proinsulin Aspart pada P. pastoris. Proinsulin Aspart dengan linker RWR dapat diekspresikan paling baik menggunakan signal peptida ?-MF tanpa spacer pada P. pastoris galur KM71. Kondisi produksi optimal untuk menghasilkan proinsulin Aspart adalah pada kondisi aerasi (rasio volume kultur terhadap ukuran labu Erlenmeyer) 1:25, kerapatan sel kultur (OD600) ~60, dan induksi metanol dengan konsentrasi akhir 2% (v/v) selama dua hari. Proinsulin Aspart yang dihasilkan mempunyai ukuran molekul 6,3 kDa, kemungkinan sudah membentuk jembatan disulfida, dan tidak ditemukan dalam bentuk terglikosilasi. Penggunaan signal peptida ?-MF tanpa spacer untuk sekresi proinsulin sangat menguntungkan karena hanya menghasilkan satu jenis proinsulin dengan bobot molekul 6,3 kDa, sesuai dengan ukuran teoritis molekul proinsulin Aspart. Penggunaan linker RWR pada desain proinsulin Aspart dapat meningkatkan tingkat ekspresi. Produksi proinsulin pada P. pastoris umumnya menggunakan galur GS115 dan X33. Pada penelitian ini, ekspresi proinsulin Aspart menunjukkan hasil terbaik pada galur KM71. Kelebihan galur KM71 adalah membutuhkan induksi metanol dengan jumlah yang lebih rendah daripada galur GS115 dan X33.