Perpustakaan Digital ITB

Sistem penghantaran protein ekstrasel Twin Arginine Translocation (TAT) pada bakteri memiliki kemampuan untuk mentranslokasikan protein dalam konformasi pelipatan yang benar. Pada bakteri Bacillus subtilis, terdapat protein TATAdCd yang dikembangkan penggunaannya di bakteri Escherichia coli untuk penghantaran protein hasil rekayasa genetika dengan permasalahan pada pelipatan di intrasel. Gen resisten antibiotik pada plasmid dalam konstruksi DNA rekombinan menjadi marka seleksi yang umum digunakan. Keberadaan marka seleksi antibiotik yang berbeda memungkinkan beberapa plasmid dimasukkan ke dalam sel inang yang sama. Penelitian ini bertujuan untuk mengonstruksi plasmid rekombinan yang membawa gen pengkode protein TATAdCd dan penambahan marka seleksi gen resisten tetrasiklin. Gen pengkode protein TATAdCd pada pTA_TATAdCd WT dan gen resisten tetrasiklin pada pBR322 diisolasi dan dikloning ke dalam pET16b. Plasmid hasil konstruksi diberi nama pET16b_TATAdCd, pET16b_TetR, dan pET16b_TATAdCd_TetR serta dikonfirmasi kebenarannya pada tingkat DNA dan protein. Pada tingkat DNA, plasmid hasil konstruksi berhasil terkonfirmasi kebenarannya dengan analisis migrasi, analisis pemotongan, dan Polymerase Chain Reaction (PCR) serta sekuensing DNA. Pada tingkat protein, ekspresi protein TATAdCd dibuktikan dengan overproduksi protein TATAdCd di sel inang E. coli BL21 (DE3) dan protein dikarakterisasi dengan SDS-PAGE Tris-Glisin. Ekspresi gen resisten tetrasiklin dibuktikan dengan penumbuhan bakteri E. coli DH5? yang membawa plasmid pET16b_TetR dan pET16b_TATAdCd_TetR pada media padat Luria Bertani yang mengandung tetrasiklin. Dalam penelitian ini, ekspresi protein TATAd dan TATCd belum dapat diamati pada SDS-PAGE Tris-Glisin sedangkan gen resisten tetrasiklin berhasil diekspresikan karena E. coli rekombinan mampu tumbuh di media seleksi tetrasiklin.