digilib@itb.ac.id +62 812 2508 8800

Quorum sensing (QS) dapat mengaktifkan sistem ekspresi gen pada bakteri patogenik, misalnya Vibrio sp. untuk memproduksi faktor virulensi utama penyebab Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease (AHPND). AHPND dapat memperburuk vibriosis dan menyebabkan kematian sehingga menurunkan produktivitas udang. Mekanisme QS ini dapat terjadi melalui akumulasi molekul sinyal kimia N-acyl homoserine lactones (AHLs). Pendekatan quorum quenching (QQ) dapat digunakan untuk menghambat QS dengan menurunkan akumulasi AHLs menggunakan enzim N-acyl homoserine lactonase. N-acyl homoserine lactonase merupakan salah satu enzim QQ yang paling banyak dipelajari karena dapat menghidrolisis cincin siklik homoserine lactone pada berbagai AHLs dengan panjang rantai molekul berbeda. N-acyl homoserine lactonase banyak ditemukan pada berbagai spesies bakteri terutama genus Bacillus, contohnya Bacillus licheniformis DAHB1. N-acyl homoserine lactonase dari B. licheniformis DAHB1 telah diekspresikan pada Escherichia coli. Enzim ini memiliki aktivitas tinggi, spesifisitas terhadap substrat yang luas, profil suhu dan pH yang luas, serta tahan terhadap kondisi asam pada usus udang dan berbagai protease. Namun, sebagian besar enzim ini cenderung membentuk agregat yang tidak larut (badan inklusi) di dalam sitoplasma E. coli. Pembentukan badan inklusi dapat menurunkan bioaktivitas dan mempersulit proses hilir protein rekombinan. Salah satu inovasi yang dapat dilakukan untuk meminimalisir proses hilir adalah sekresi N-acyl homoserine lactonase dari sitoplasma ke periplasma dan ekstraseluler sel E. coli BL21 (DE3). Sekresi N-acyl homoserine lactonase ke periplasma dan ekstraseluler sel E. coli BL21 (DE3) dapat dilakukan dengan rekayasa genetika. Rekayasa genetika yang dilakukan melibatkan penambahan peptida sinyal PelB yang terdapat dalam vektor ekspresi pET-26b(+) dan 20 asam amino N-terminal (N20) dari domain katalitik cellulase Bacillus sp. Z-16 pada bagian awal protein rekombinan. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan untuk mengekspresikan N-acyl homoserine lactonase dari B. licheniformis DAHB1 dan mensekresikannya ke bagian periplasma dan ekstraseluler pada E. coli BL21 (DE3) menggunakan plasmid rekombinan pET-26b(+)-aiiA-6xHis dan pET-26b(+)-N20-aiiA-6xHis. Penelitian ini dilakukan dalam beberapa tahap meliputi studi bioinformatika dan sintesis N-acyl homoserine lactonase, transformasi plasmid rekombinan pada E. coli BL21 (DE3), sekresi protein rekombinan pada suhu 25°C dengan perlakuan variasi waktu inkubasi setelah induksi 0,5 mM IPTG (16, 20, dan 38 jam) dan konsentrasi IPTG (0; 0,5; 0,75; dan 1 mM). Isolasi protein rekombinan dari periplasma dan ekstraseluler masing-masing dilakukan menggunakan osmotic shock method dan protein concentrator. Analisis sekresi pita protein rekombinan pada gel SDS-PAGE dilakukan dengan menggunakan ImageJ. Purifikasi protein rekombinan dilakukan dengan menggunakan Ni-NTA spin columns. Dialisis protein rekombinan dilakukan dengan menggunakan tabung dialisis. Uji aktivitas enzim dihitung berdasarkan penurunan substrat yang diukur menggunakan UPLC-ESI-MRM/MS. Hasil studi bioinformatika memprediksikan N-acyl homoserine lactonase dari B. licheniformis DAHB1 memiliki perbedaan residu asam amino posisi 73 dan 138 yang diduga mencirikan spesifisitas terhadap substrat. Penambahan N20 pada protein target menyebabkan asam amino polar muatan negatif terkonsentrasi di bagian N-terminal sehingga N-terminal protein target bersifat hyperexporter. Mature protein aiiA-6xHis (29,14 kDa) dan N20-aiiA-6xHis (31,61 kDa) diprediksi bersifat larut (soluble) dan dapat disekresikan ke periplasma dan ekstraseluler sel E. coli BL21 (DE3). Penambahan N20 dan His-Tag pada protein target diprediksi menyebabkan perbedaan struktur tersier pada bagian N-terminal dan C-terminal. Konfirmasi DNA sequencing menunjukkan bahwa tidak ada mutasi pada urutan nukleotida dari dua gen target. Hasil sekresi protein rekombinan menunjukkan bahwa persentase rasio aiiA-6xHis paling tinggi (p <0,05) sebesar 11,58% diamati di bagian periplasma pada kondisi pertumbuhan 25°C dan 20 jam inkubasi setelah induksi 0,75 mM IPTG. Persentase rasio N20-aiiA-6xHis paling tinggi (p <0,05) sebesar 14,58% disekresikan di bagian periplasma pada kondisi pertumbuhan yang sama dengan induksi 0,5 mM IPTG. Persentase rasio aiiA-6xHis (p <0,05) dan N20-aiiA-6xHis (p <0,05) paling tinggi masing-masing sebesar 4,64 dan 5,76% disekresikan di bagian ekstraseluler pada kondisi pertumbuhan 25°C dan 16 jam inkubasi setelah induksi 0,5 mM IPTG. Berdasarkan analisis sekresi pada lokasi seluler yang berbeda, kedua protein rekombinan paling tinggi (p <0,05) disekresikan di bagian periplasma daripada ekstraseluler. Protein rekombinan fraksi periplasma yang dipurifikasi telah dikonfirmasi dapat menghidrolisis AHLs jenis N-hexanoyl-L-Homoserine lactone (C6-HSL). Aktivitas enzim aiiA-6xHis dan N20-aiiA-6xHis terhadap C6-HSL masing-masing adalah 2,7x10-3 dan 2,3x10-3 ?mol/menit/mg dalam 10 menit reaksi. Persentase substrat C6-HSL yang dihidrolisis oleh enzim aiiA-6xHis dan N20-aiiA-6xHis masing-masing adalah 65,26 dan 64,4%. Hasil ini didukung dengan keberadaan produk hasil hidrolisis C6-HSL (C6-HS) yang diperkirakan terdapat pada rentang deteksi ion (m/z) 218,2. Kesimpulan dari penelitian ini adalah N-acyl homoserine lactonase dari B. licheniformis DAHB1 dapat diekspresikan dan disekresikan lebih tinggi di bagian periplasma daripada ekstraseluler pada E. coli BL21 (DE3) menggunakan plasmid rekombinan pET-26b(+)-aiiA-6xHis dan pET-26b(+)-N20-aiiA-6xHis.