Perpustakaan Digital ITB

Rekayasa terhadap mikroba untuk menghasilkan senyawa bahan alam yang berguna dalam dunia medis ataupun industri. Dengan status sebagai bakteri yang dikenal aman dan kapasitas jalur biosintesis endogen yang tinggi menjadikan Bacillus subtilis berpotensi untuk dikembangkan sebagai bakteri penghasil senyawa terpenoid. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengembangkan B. subtilis yang mampu memproduksi amorfadiena dan taxadiena dengan titer yang tinggi melalui peningkatan ekspresi jalur endogenus metil eritritol fosfat (MEP) atau dengan mengintegrasikan jalur mevalonat (MVA). Sebagai langkah awal, peningkatan ekspresi jalur biosintesis terpenoid endogen dapat diwujudkan dengan konstruksi operon sintesis teregulasi yang terdiri dari delapan gen jalur MEP beserta ispA yang mengkode farnesil difosfat sintase. Operon yang dikonstruksi pada plasmid bereplikasi theta memiliki stabilitas segresional dan struktural yang lebih baik dibandingkan dengan plasmid bereplikasi rolling circle (RCR). Koekspresi gen crtM dan crtN pada B. subtilis yang membawa plasmid operon sintetik gen-gen jalur MEP menghasilkan karotenoid C30 hingga mencapai 20mg/g berat sel kering. B. subtilis yang membawa plasmid berisi operon sintetik gen-gen jalur MEP secara stabil kemudian digunakan untuk memproduksi taksadiena, prekursor utama untuk obat antikanker paklitaksel. Taksadiena sebagai suatu senyawa diterpenoid membutuhkan geranilgeranil difosfat (GGDP) sebagai prazat yang disuplai oleh geranilgeranil difosfat sintase yang dikode oleh gen crtE berasal dari Pantoea ananatis. Penelitian ini selain berhasil memproduksi taksadiena pada tingkatan yang dapat diapresiasi (hingga 17,8 mg/L), juga menunjukkan bahwa dua plasmid bereplikasi theta dapat secara stabil diekspresikan secara bersamaan. Hal ini dapat menjadi bekal bagi riset rekayasa B. subtilis selanjutnya. Amorfadiena merupakan prazat penting dalam biosintesis artemisinin. Untuk memproduksi amorfadiena pada tataran ekonomis dan berkelanjutan diperlukan organisme yang optimum. Amorfadiena sintase (Ads) diekspresikan dengan buruk pada B. subtilis. Modifikasi melalui fusi ujung N enzim dengan protein berpendar hijau (Gfp) mampu meningkatan ekspresi amorfadiena sintase. Kombinasi antara co-ekspresi protein Gfp-Ads dengan operon sintetik jalur MEP beserta optimisasi medium berhasil meningkatkan produksi amorfadiena hingga mencapai 416±15 mg/L pada skala labu Erlenmeyer. Optimasi medium menunjukkan bahwa suplai piruvat sebagai prazat bagi jalur biosintesis MEP serta pengaturan pH merupakan dua elemen penting dalam proses fermentasi. Pada tahap selanjutnya dalam rangka meningkatkan capaian produksi amorfadiena, jalur heterolog mevalonat (MVA) dikonstruksi dengan melibatkan gen-gen pengkode bagian atas dan bagian bawah jalur MVA dari Enterococcus faecalis dan Streptococcus pneumoniae secara berurutan. Ekspresi bagian atas dari jalur tersebut mengakibatkan B. subtilis dapat menghasilkan asam mevalonat namun belum mencapai tingkatan yang mampu mencukupi untuk produksi amorfadiena. Gabungan antara ekspresi jalur mevalonat, peningkatan ekspresi isopentenil difosfat sintase (Idi) dan farnesil difosfat sintase (IspA) beserta suplementasi asam mevalonat hingga 40 mM mampu meningkatkan produksi amorfadiena hingga mencapai 800 mg/L. Hal ini menunjukkan bahwa jalur mevalonat, terutama bagian bawah telah berfungsi dengan baik. Namun demikian, bagian atas dari jalur tersebut masih memerlukan penelitian lebih lanjut dalam rangka peningkatan kapasitas produksi asam mevalonat. Secara keseluruahan, penelitian ini telah mampu memberikan gambaran tentang pencapaian rekyasa metabolik dan potensi pengembangan lebih lanjut B. subtilis sebagai bakteri penghasil senyawa terpenoid.