Senyawa β-glukan merupakan senyawa penyusun dinding sel jamur yang berperan sebagai immunomodulator. Beta glukan ditemukan pada hampir seluruh jenis jamur, termasuk pada Sclerotium rolfsii., jamur Basidiomycota yang berpotensi sebagai sumber beta glukan. Pemanfaatan jamur Sclerotium rolfsii., mendukung upaya eksplorasi potensi jamur lokal dalam bidang kesehatan. Penelitian ini dilakukan untuk melihat pengaruh variasi sumber dan konsentrasi karbon kompleks dan sumber nitrogen terhadap pertumbuhan jamur Sclerotium rolfsii serta optimasi produksi β-glukan dengan variasi kecepatan agitasi. Tahapan penelitian yang dilakukan meliputi (1) identifikasi molekuler isolat jamur; (2) screening medium padat variasi sumber karbon (tepung maizena, beras, dan tapioka); sumber nitrogen (kaldu ikan, kaldu ayam, dan telur), sumber gula dan konsentrasi sumber C (5%,10%,dan 15%) dan N (2,5%,10%, dan 15%) dengan menggunakan pengukuran radial pertumbuhan miselium jamur dan berat kering; (3) optimasi kadar β-glukan pada medium terpilih dengan variasi perlakuan kecepatan agitasi 100,125,dan 150 rpm dengan metode berat kering; dan (4) kuantifikasi senyawa β-glukan larut air dengan metode berat kering. Dari hasil screening, diperoleh medium yang menghasilkan pertumbuhan miselium jamur lebih cepat adalah variasi medium maizena, kaldu ikan, dan sukrosa dengan perbandingan konsentrasi sumber C dan N yaitu 15% : 10%. Dari hasil optimasi kecepatan agitasi, diperoleh kadar β-glukan larut air yang tertinggi yaitu pada perlakuan agitasi 150 rpm dengan berat kering terukur adalah 76,9 mg yang dicapai pada waktu inkubasi 168 jam, diikuti dengan kadar berat kering β-glukan pada perlakuan agitasi 125 rpm (61,6 gram,192 jam) dan perlakuan agitasi 100 rpm (56,7 gram,192 jam). Dari hasil penelitian ini, diketahui medium dengan sumber karbon maizena, sumber nitrogen kaldu ikan dan sumber gula sukrosa dengan perbandingan konsentrasi sumber C : N 15% : 10% yang dioptimasi pada kecepatan agitasi 150 rpm dapat menghasilkan pertumbuhan miselium dan produksi β-glukan mencapai 76,9 mg.