Mikroorganisme termofilik yang hidup pada daerah dengan temperatur tinggi,
memiliki potensi untuk dikembangkan dalam bioteknologi molekul maupun
bidang industri karena mampu menghasilkan enzim termostabil. Karena
kebutuhan akan enzim termostabil yang terus meningkat, maka eksplorasi
terhadap mikroorganisme termofilik terus dilakukan. Pada penelitian sebelumnya,
fragmen gen 1,9 kb telah berhasil diisolasi dari Kawah Domas, Jawa Barat
melalui pendekatan metagenom. Fragmen gen tersebut telah berhasil dikloning ke
dalam vektor pJET1.2/blunt. Berdasarkan analisis awal secara bioinformatik
diketahui fragmen gen tersebut membawa ORF utuh dari protein aldolase kelas II.
Sehingga pada penelitian ini telah dilakukan kloning dan ekspresi gen pengkode
aldolase kelas II dari fragmen gen 1,9 kb hasil pendekatan metagenom dari kawah
Domas. Penelitian ini diharapkan dapat menambah database tentang
keanekaragaman mikroorganisme hipertermofil dan enzim hipertermostabil dari
isolat lokal Indonesia.
Hasil analisis fragmen gen 1,9 kb dengan pendekatan bioinformatik menunjukkan
adanya tiga Open Reading Frame (ORF), antara lain gen pengkode Fe-S
Oksidoreduktase, aldolase kelas II dan sitrat sintase. Dengan menggunakan
BLAST pada NCBI, protein – protein tersebut diketahui memiliki homologi
tertinggi dengan protein sejenis dari Acidilobus saccharovorans dengan persen
homologi berturut – turut 91%, 78%, dan 61% untuk Sitrat sintase, Fe-S
Oxidoreduktase dan aldolase kelas II. Ketiga protein diketahui memiliki peranan
dalam proses metabolisme pada A. saccharovorans terutama pada proses
glikolisis. Namun demikian, hanya ORF Aldolase kelas II (aldII) yang merupakan
suatu ORF utuh dengan panjang basa, 639 pb. Untuk keperluan ekspresi, gen
pengkode protein aldolase kelas II (aldII) utuh telah diamplifikasi dan diligasi ke
dalam vektor kloning pGEM-T Easy vector menghasilkan plasmid pGEM-T
rekombinan yang disebut pGEM-aldII. Fragmen aldII pada plasmid rekombinan
tersebut selanjutnya diisolasi dan disubkloning dalam vektor ekspresi pET-30a(+).
Deduksi urutan nukleotida aldII menghasilkan urutan asam amino aldolase kelas
II (AldII) sepanjang 196 asam amino. Penentuan sifat – sifat biokimia in silico
dari AldII dilakukan dengan menganalisis urutan tersebut menggunakan
webserver Protparam pada situs ExPASy. Hasil analisis menyarankan berat
molekul AldII sebesar ~21,2 kDa dengan rumus molekul C940H1539N261O281S8.
iii
Total residu bermuatan negatif (Asp+Glu) sebanyak 22 residu, sedangkan total
residu bermuatan positif (Arg+Lys) adalah 18 residu. Nilai pI teoritis protein ini
adalah 5,86. Hasil perhitungan index kestabilan protein adalah 36,61 dan
diklasifikasikan sebagai protein stabil. Pemodelan struktur 3D dilakukan dengan
menggunakan pendekatan ab initio yang disediakan pada progam QUARK.
Protein AldII diprediksi memiliki strukur dengan topologi 6 beta sheet dan 6 alfa
heliks.
Vektor rekombinan pET30-aldII yang diekspresi pada sel inang E. coli BL21
(DE3) dengan dua konsentrasi induksi isopropiltiogalaktosa (IPTG) yang berbeda
(0,5 mM dan 1 mM) menghasilkan pita protein aldolase rekombinan (AldII)
dengan massa molekul ~26 kDa. Hasil penentuan konsentrasi protein
menggunakan metode Bradford menunjukkan konsentrasi masing - masing
protein kasar AldII berturut – turut adalah 11 mg/μL dan 7,38 mg/μL untuk
konsentrasi IPTG sebesar 0,5 mM dan 1 mM. Penentuan tingkat ekspresi
menggunakan progam ImageJ menunjukkan bahwa protein AldII terekspresi
masing – masing sebesar 39,78 % dan 31,87 % untuk konsentrasi IPTG 0,5 mM
dan 1 mM. Protein AldII rekombinan diduga merupakan suatu protein yang
termostabil setelah dipanaskan selama 30 menit pada temperatur 60 oC dan telah
berhasil dimurnikan dengan menggunakan Ni-NTA, dengan tingkat kemurnian
relatif 88,44 % sebelum pemanasan dan meningkat menjadi 97,6% setelah pemanasan.