digilib@itb.ac.id +62 812 2508 8800

Mikroorganisme termofilik yang hidup pada daerah dengan temperatur tinggi, memiliki potensi untuk dikembangkan dalam bioteknologi molekul maupun bidang industri karena mampu menghasilkan enzim termostabil. Karena kebutuhan akan enzim termostabil yang terus meningkat, maka eksplorasi terhadap mikroorganisme termofilik terus dilakukan. Pada penelitian sebelumnya, fragmen gen 1,9 kb telah berhasil diisolasi dari Kawah Domas, Jawa Barat melalui pendekatan metagenom. Fragmen gen tersebut telah berhasil dikloning ke dalam vektor pJET1.2/blunt. Berdasarkan analisis awal secara bioinformatik diketahui fragmen gen tersebut membawa ORF utuh dari protein aldolase kelas II. Sehingga pada penelitian ini telah dilakukan kloning dan ekspresi gen pengkode aldolase kelas II dari fragmen gen 1,9 kb hasil pendekatan metagenom dari kawah Domas. Penelitian ini diharapkan dapat menambah database tentang keanekaragaman mikroorganisme hipertermofil dan enzim hipertermostabil dari isolat lokal Indonesia. Hasil analisis fragmen gen 1,9 kb dengan pendekatan bioinformatik menunjukkan adanya tiga Open Reading Frame (ORF), antara lain gen pengkode Fe-S Oksidoreduktase, aldolase kelas II dan sitrat sintase. Dengan menggunakan BLAST pada NCBI, protein – protein tersebut diketahui memiliki homologi tertinggi dengan protein sejenis dari Acidilobus saccharovorans dengan persen homologi berturut – turut 91%, 78%, dan 61% untuk Sitrat sintase, Fe-S Oxidoreduktase dan aldolase kelas II. Ketiga protein diketahui memiliki peranan dalam proses metabolisme pada A. saccharovorans terutama pada proses glikolisis. Namun demikian, hanya ORF Aldolase kelas II (aldII) yang merupakan suatu ORF utuh dengan panjang basa, 639 pb. Untuk keperluan ekspresi, gen pengkode protein aldolase kelas II (aldII) utuh telah diamplifikasi dan diligasi ke dalam vektor kloning pGEM-T Easy vector menghasilkan plasmid pGEM-T rekombinan yang disebut pGEM-aldII. Fragmen aldII pada plasmid rekombinan tersebut selanjutnya diisolasi dan disubkloning dalam vektor ekspresi pET-30a(+). Deduksi urutan nukleotida aldII menghasilkan urutan asam amino aldolase kelas II (AldII) sepanjang 196 asam amino. Penentuan sifat – sifat biokimia in silico dari AldII dilakukan dengan menganalisis urutan tersebut menggunakan webserver Protparam pada situs ExPASy. Hasil analisis menyarankan berat molekul AldII sebesar ~21,2 kDa dengan rumus molekul C940H1539N261O281S8. iii Total residu bermuatan negatif (Asp+Glu) sebanyak 22 residu, sedangkan total residu bermuatan positif (Arg+Lys) adalah 18 residu. Nilai pI teoritis protein ini adalah 5,86. Hasil perhitungan index kestabilan protein adalah 36,61 dan diklasifikasikan sebagai protein stabil. Pemodelan struktur 3D dilakukan dengan menggunakan pendekatan ab initio yang disediakan pada progam QUARK. Protein AldII diprediksi memiliki strukur dengan topologi 6 beta sheet dan 6 alfa heliks. Vektor rekombinan pET30-aldII yang diekspresi pada sel inang E. coli BL21 (DE3) dengan dua konsentrasi induksi isopropiltiogalaktosa (IPTG) yang berbeda (0,5 mM dan 1 mM) menghasilkan pita protein aldolase rekombinan (AldII) dengan massa molekul ~26 kDa. Hasil penentuan konsentrasi protein menggunakan metode Bradford menunjukkan konsentrasi masing - masing protein kasar AldII berturut – turut adalah 11 mg/μL dan 7,38 mg/μL untuk konsentrasi IPTG sebesar 0,5 mM dan 1 mM. Penentuan tingkat ekspresi menggunakan progam ImageJ menunjukkan bahwa protein AldII terekspresi masing – masing sebesar 39,78 % dan 31,87 % untuk konsentrasi IPTG 0,5 mM dan 1 mM. Protein AldII rekombinan diduga merupakan suatu protein yang termostabil setelah dipanaskan selama 30 menit pada temperatur 60 oC dan telah berhasil dimurnikan dengan menggunakan Ni-NTA, dengan tingkat kemurnian relatif 88,44 % sebelum pemanasan dan meningkat menjadi 97,6% setelah pemanasan.