Morus merupakan salah satu genus penting dalam famili Moraceae disamping
Artocarpus dan Ficus. Tumbuhan Morus telah dimanfaatkan sebagai pakan ulat
sutra, selain itu buahnya dapat dimakan, serta kayunya digunakan sebagai bahan
bangunan. Tumbuhan genus Morus menghasilkan senyawa golongan fenolik
seperti adduct Diels-Alder, flavonoid, 2-arilbenzofuran, dan stilben, yang
memiliki bioaktivitas seperti antifungal, antioksidan, antimikroba dan lain-lain.
Penelitian terhadap tumbuhan Morus yang dikembangkan melalui teknik kultur
jaringan, telah berhasil mengisolasi berbagai senyawa turunan fenol terutama
adduct Diels-Alder. Senyawa adduct Diels-Alder pada tumbuhan ini terbentuk
melalui reaksi sikloadisi antara suatu calkon sebagai dienofil dengan berbagai
dehidroprenil fenol lainnya (dehidroprenil stilben, dehidroprenil flavonoid, dan
dehidroprenil-2-arilbenzofuran) sebagai diena. Reaksi ini diduga dikatalisis oleh
Diels-Alderase pada jalur biosintesisnya. Penelitian pendahuluan menunjukkan
adduct Diels-Alder lebih dominan ditemukan pada kultur akar, sehingga kultur
akar M. cathayana digunakan sebagai sumber enzim dalam penelitian ini,
sedangkan untuk substrat digunakan isobavacalkon. Penelitian awal mengenai
aktivitas Diels-Alderase dari tumbuhan Morus telah pernah dilaporkan
sebelumnya, begitu juga dengan kondisi optimum Diels-Alderase, namun
karakterisasi Diels-Alderase belum pernah dilaporkan. Oleh karena itu, maka
dilakukan isolasi dan karakterisasi enzim Diels-Alderase dari tumbuhan Morus.
Tahapan penelitian ini meliputi proses homogenasi, ekstraksi, fraksinasi dan
ii
pemurnian. Kultur akar dihomogenasi dengan menggunakan nitrogen cair, dan
pemecahan sel secara mekanik dengan bantuan mortar dan pastel, dilanjutkan
dengan ekstraksi protein menggunakan bufer pengekstrak, dan bagian
supernatannya merupakan ekstrak kasar enzim Diels-Alderase. Uji aktivitas
dilakukan dengan menginkubasikan isobavacalkon, ekstrak kasar enzim dan bufer
fosfat selama 16 jam pada 37oC. Produk reaksi dianalisis menggunakan HPLC
kolom fasa terbalik dengan eluen metanol-air yang mengandung asam fosfat,
diukur pada panjang gelombang 370 nm. Kromatogram HPLC untuk standar
substrat dan standar produk muncul pada waktu retensi 4 menit dan 8 menit
berturut-turut. Kromatogram HPLC menunjukkan waktu retensi kuwanon V
(produk reaksi) 8 menit, sama dengan waktu retensi standar produk. Analisis
selanjutnya menggunakan LC-MS, hasil LC-MS juga turut memperkuat dugaan
terbentuknya puncak dengan spektrum massa ion (M+H)+ = 647, yang sama
dengan spektrum massa ion produk kuwanon V. Setelah terdeteksi aktivitas Diels-
Alderase dari ekstrak kasar, dilanjutkan dengan fraksinasi menggunakan
ammonium sulfat. Hasil uji aktivitas menunjukkan fraksi 40-60% memiliki
aktivitas tertinggi, dan diperkuat dengan SDS PAGE, yang menunjukkan pita
dominan pada fraksi tersebut. Kemudian dilakukan perbanyakan sampel terhadap
fraksi maksimum Diels-Alderase dan ditentukan konsentrasi protein
menggunakan metode Bradford. Pemurnian parsial Diels-Alderase menggunakan
kromatografi penukar anion dengan matriks DEAE-650M, hasil kromatografi
diidentifikasi melalui SDS PAGE. Elusi menggunakan bufer fosfat yang
mengandung konsentrasi NaCl 300 mM dan 500 mM memperlihatkan pita protein
yang dominan dengan berat molekul 40-60 kDa. Fraksi elusi 500 mM NaCl
mempunyai aktivitas Diels-Alderase tertinggi, dengan aktivitas spesifik 790,08
Unit/mg protein, dimana nilai ini setara dengan kelipatan kemurnian sebesar 14
kali dibandingkan fraksinasi ammonium sulfat. Berdasarkan hasil tersebut dapat
disimpulkan bahwa telah berhasil diisolasi Diels-Alderase dari kultur akar
tanaman M. cathayana dan pemurnian parsial terhadap enzim Diels-Alderase
diperkirakan mempunyai berat molekul sebesar 40-60 kDa.