digilib@itb.ac.id +62 812 2508 8800

Morus merupakan salah satu genus penting dalam famili Moraceae disamping Artocarpus dan Ficus. Tumbuhan Morus telah dimanfaatkan sebagai pakan ulat sutra, selain itu buahnya dapat dimakan, serta kayunya digunakan sebagai bahan bangunan. Tumbuhan genus Morus menghasilkan senyawa golongan fenolik seperti adduct Diels-Alder, flavonoid, 2-arilbenzofuran, dan stilben, yang memiliki bioaktivitas seperti antifungal, antioksidan, antimikroba dan lain-lain. Penelitian terhadap tumbuhan Morus yang dikembangkan melalui teknik kultur jaringan, telah berhasil mengisolasi berbagai senyawa turunan fenol terutama adduct Diels-Alder. Senyawa adduct Diels-Alder pada tumbuhan ini terbentuk melalui reaksi sikloadisi antara suatu calkon sebagai dienofil dengan berbagai dehidroprenil fenol lainnya (dehidroprenil stilben, dehidroprenil flavonoid, dan dehidroprenil-2-arilbenzofuran) sebagai diena. Reaksi ini diduga dikatalisis oleh Diels-Alderase pada jalur biosintesisnya. Penelitian pendahuluan menunjukkan adduct Diels-Alder lebih dominan ditemukan pada kultur akar, sehingga kultur akar M. cathayana digunakan sebagai sumber enzim dalam penelitian ini, sedangkan untuk substrat digunakan isobavacalkon. Penelitian awal mengenai aktivitas Diels-Alderase dari tumbuhan Morus telah pernah dilaporkan sebelumnya, begitu juga dengan kondisi optimum Diels-Alderase, namun karakterisasi Diels-Alderase belum pernah dilaporkan. Oleh karena itu, maka dilakukan isolasi dan karakterisasi enzim Diels-Alderase dari tumbuhan Morus. Tahapan penelitian ini meliputi proses homogenasi, ekstraksi, fraksinasi dan ii pemurnian. Kultur akar dihomogenasi dengan menggunakan nitrogen cair, dan pemecahan sel secara mekanik dengan bantuan mortar dan pastel, dilanjutkan dengan ekstraksi protein menggunakan bufer pengekstrak, dan bagian supernatannya merupakan ekstrak kasar enzim Diels-Alderase. Uji aktivitas dilakukan dengan menginkubasikan isobavacalkon, ekstrak kasar enzim dan bufer fosfat selama 16 jam pada 37oC. Produk reaksi dianalisis menggunakan HPLC kolom fasa terbalik dengan eluen metanol-air yang mengandung asam fosfat, diukur pada panjang gelombang 370 nm. Kromatogram HPLC untuk standar substrat dan standar produk muncul pada waktu retensi 4 menit dan 8 menit berturut-turut. Kromatogram HPLC menunjukkan waktu retensi kuwanon V (produk reaksi) 8 menit, sama dengan waktu retensi standar produk. Analisis selanjutnya menggunakan LC-MS, hasil LC-MS juga turut memperkuat dugaan terbentuknya puncak dengan spektrum massa ion (M+H)+ = 647, yang sama dengan spektrum massa ion produk kuwanon V. Setelah terdeteksi aktivitas Diels- Alderase dari ekstrak kasar, dilanjutkan dengan fraksinasi menggunakan ammonium sulfat. Hasil uji aktivitas menunjukkan fraksi 40-60% memiliki aktivitas tertinggi, dan diperkuat dengan SDS PAGE, yang menunjukkan pita dominan pada fraksi tersebut. Kemudian dilakukan perbanyakan sampel terhadap fraksi maksimum Diels-Alderase dan ditentukan konsentrasi protein menggunakan metode Bradford. Pemurnian parsial Diels-Alderase menggunakan kromatografi penukar anion dengan matriks DEAE-650M, hasil kromatografi diidentifikasi melalui SDS PAGE. Elusi menggunakan bufer fosfat yang mengandung konsentrasi NaCl 300 mM dan 500 mM memperlihatkan pita protein yang dominan dengan berat molekul 40-60 kDa. Fraksi elusi 500 mM NaCl mempunyai aktivitas Diels-Alderase tertinggi, dengan aktivitas spesifik 790,08 Unit/mg protein, dimana nilai ini setara dengan kelipatan kemurnian sebesar 14 kali dibandingkan fraksinasi ammonium sulfat. Berdasarkan hasil tersebut dapat disimpulkan bahwa telah berhasil diisolasi Diels-Alderase dari kultur akar tanaman M. cathayana dan pemurnian parsial terhadap enzim Diels-Alderase diperkirakan mempunyai berat molekul sebesar 40-60 kDa.