Perpustakaan Digital ITB

Ancaman dari Highly Pathogenic Avian Influenza Virus (HPAIV) H5N1 dan Campylobacter jejuni berisiko tinggi terhadap produktivitas dan keamanan pangan di industri ternak unggas. Untuk mengatasi ancaman tersebut, penelitian ini mengembangkan kandidat vaksin glikokonjugat multivalen berbasis antigen hemagglutinin (HA) dari H5N1 sebagai protein akseptor dan N-glikan dari C. jejuni sebagai glikan konjugat. Sistem ekspresi mengintegrasikan Escherichia coli galur SHuffle, peptida sinyal dari trimethylamine-N-oxide reductase (TorA) untuk jalur translokasi twin-arginine translocation (TAT), serta Protein Glycan Coupling Technology (PGCT) untuk memfasilitasi pelipatan secara sitosolik, translokasi, dan glikosilasi protein di periplasma. Konstruk ekspresi pTorA-rH5-GT (6248 bp) dirakit melalui overlapextension polymerase chain reaction dan Gibson assembly, serta berhasil dikonfirmasi dengan ukuran dan sekuens yang sesuai. Konstruk lalu dikotransformasi ke E. coli SHuffle bersama plasmid pACYC184:pgl dengan metode kejut panas untuk ekspresi komponen glikosilasi C. jejuni secara konstitutif. Protein rH5-GT merupakan modifikasi HA HPAIV galur A/Indonesia/5/2005 klad 2.1 tanpa multibasic cleavage site, serta mengandung tag Nglikosilasi (GT) dengan sequon DQNAT dan tag 6xHis untuk immunoblotting. Ekspresi protein diregulasi oleh promotor tac dan diinduksi dengan 0,25 mM isopropil ?-D-1- tiogalaktopiranosid (IPTG) pada kondisi induksi 25 °C selama 4 jam, 30 °C selama 4 jam, dan 25 °C selama 16 jam. Analisis Western blot terhadap fraksi total, terlarut, dan periplasma menggunakan antibodi primer anti-His tag (1:3000) dan lektin soybean agglutinin (SBA) (1:500) menunjukkan bahwa protein TorA-rH5-GT terekspresi di seluruh kondisi, tetapi dalam bentuk tidak terglikosilasi (~68,9 kDa). Ekspresi paling optimal diperoleh pada kondisi 25 °C dan 30 °C selama 4 jam dengan tingkat solubilitas dan efisiensi translokasi yang secara signifikan ~2,5 dan ~4 kali lipat lebih tinggi (p < 0,05; uji ANOVA Welch; uji post-hoc Games- Howell) dibandingkan E. coli SCM6 yang umum digunakan untuk ekspresi glikoprotein. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh efisiensi pelipatan yang lebih baik dalam sitoplasma oksidatif SHuffle dan mengindikasikan bahwa translokasi melalui jalur TAT berlangsung lebih efektif. Meskipun demikian, waktu induksi 16 jam menyebabkan penurunan performa ekspresi. Sementara itu, sinyal glikosilasi tidak ditemukan pada seluruh kondisi. Hal ini kemungkinan karena pelipatan penuh protein di sitoplasma menghambat aksesibilitas sequon oleh enzim PglB. Temuan ini mendemonstrasikan potensi penggunaan E. coli SHuffle dengan jalur translokasi TAT sebagai sistem ekspresi yang unggul untuk produksi protein rekombinan yang kompleks, seperti protein HA, sekaligus juga menyoroti pentingnya sistem ekspresi yang dapat menjaga aksesibilitas sequon selama proses translokasi sebagai salah satu faktor keberhasilan glikosilasi secara heterolog.