Perpustakaan Digital ITB

Sortase merupakan protease dan transpeptidase sistein yang mengatalisis perakitan dan penjangkaran protein permukaan secara kovalen ke peptidoglikan dinding sel bakteri Gram-positif. Sortase D terlibat dalam pembentukan spora pada Bacillus anthracis. Urutan nukleotida gen pengode sortase D (srtD) yang berasal dari bakteri laut Rossellomorea aquimaris MKSC 6.2 (RaqsrtD) telah ditentukan pada penelitian sebelumnya, yaitu berukuran 540 pb. Oleh karena ekspresi gen pengode protein tersebut belum dilakukan, tujuan penelitian ini adalah mengonstruksi plasmid rekombinan pET-16b-srtD dan mengekspresikan srtD R. aquimaris MKSC 6.2 pada Escherichia coli. Penelitian diawali dengan perancangan primer berdasarkan urutan nukleotida RaqsrtD dengan penambahan sisi pemotongan enzim XhoI dan BamHI. Perbanyakan gen srtD dengan metode PCR (polymerase chain reaction) dilakukan menggunakan templat plasmid pGEM-T Easy-RaqsrtD dengan suhu optimum annealing 46,4 ?. Hasil fragmen PCR selanjutnya disisipkan pada vektor kloning pGEM-T Easy. Sel kompeten E. coli TOP10F’ ditransformasi dengan plasmid rekombinan pGEM-T Easy-srtD. Plasmid rekombinan pGEM-T Easy-srtD yang sesuai target selanjutnya direstriksi untuk mengisolasi srtD dan disisipkan pada vektor ekspresi pET-16b. E. coli TOP10F’ ditransformasi dengan plasmid rekombinan pET-16b-srtD untuk perbanyakan. Sel transforman tersebut dikarakterisasi dengan analisis restriksi, PCR koloni, dan penentuan urutan nukleotida dengan metode Sanger. Plasmid rekombinan pET-16b-srtD yang diinginkan, dipakai untuk mentransformasi E. coli BL21(DE3). Ekspresi srtD dilakukan dan Sortase D terbentuk sebagai protein larut di E. coli BL21(DE3) berukuran ~28,3 kDa dengan kondisi produksi optimal menggunakan media pertumbuhan Luria Bertani, IPTG 0,1 mM sebagai penginduksi, dan diinkubasi pada suhu ruang selama 3 jam. Sortase D yang larut tersebut selanjutnya dimurnikan dan dipekatkan, sehingga Sortase D memiliki konsentrasi sebesar 142 ?g/mL. Pemetaan peptida dengan LC-MS/MS untuk mengetahui urutan protein menunjukkan bahwa urutan yang dihasilkan sesuai teoritis dengan % coverage sebesar 99,51. Hasil penjajaran menunjukkan urutan tersebut adalah Sortase D yang memiliki kekerabatan terdekat dengan Bacillus sp. Marseille-Q1617 dan R. oryzaecorticis.