Sortase merupakan protease dan transpeptidase sistein yang mengatalisis perakitan dan
penjangkaran protein permukaan secara kovalen ke peptidoglikan dinding sel bakteri
Gram-positif. Sortase D terlibat dalam pembentukan spora pada Bacillus anthracis. Urutan
nukleotida gen pengode sortase D (srtD) yang berasal dari bakteri laut
Rossellomorea aquimaris MKSC 6.2 (RaqsrtD) telah ditentukan pada penelitian
sebelumnya, yaitu berukuran 540 pb. Oleh karena ekspresi gen pengode protein tersebut
belum dilakukan, tujuan penelitian ini adalah mengonstruksi plasmid rekombinan
pET-16b-srtD dan mengekspresikan srtD R. aquimaris MKSC 6.2 pada Escherichia coli.
Penelitian diawali dengan perancangan primer berdasarkan urutan nukleotida RaqsrtD
dengan penambahan sisi pemotongan enzim XhoI dan BamHI. Perbanyakan gen srtD
dengan metode PCR (polymerase chain reaction) dilakukan menggunakan templat plasmid
pGEM-T Easy-RaqsrtD dengan suhu optimum annealing 46,4 ?. Hasil fragmen PCR
selanjutnya disisipkan pada vektor kloning pGEM-T Easy. Sel kompeten E. coli TOP10F’
ditransformasi dengan plasmid rekombinan pGEM-T Easy-srtD. Plasmid rekombinan
pGEM-T Easy-srtD yang sesuai target selanjutnya direstriksi untuk mengisolasi srtD dan
disisipkan pada vektor ekspresi pET-16b. E. coli TOP10F’ ditransformasi dengan plasmid
rekombinan pET-16b-srtD untuk perbanyakan. Sel transforman tersebut dikarakterisasi
dengan analisis restriksi, PCR koloni, dan penentuan urutan nukleotida dengan metode
Sanger. Plasmid rekombinan pET-16b-srtD yang diinginkan, dipakai untuk
mentransformasi E. coli BL21(DE3). Ekspresi srtD dilakukan dan Sortase D terbentuk
sebagai protein larut di E. coli BL21(DE3) berukuran ~28,3 kDa dengan kondisi produksi
optimal menggunakan media pertumbuhan Luria Bertani, IPTG 0,1 mM sebagai
penginduksi, dan diinkubasi pada suhu ruang selama 3 jam. Sortase D yang larut tersebut
selanjutnya dimurnikan dan dipekatkan, sehingga Sortase D memiliki konsentrasi sebesar
142 ?g/mL. Pemetaan peptida dengan LC-MS/MS untuk mengetahui urutan protein
menunjukkan bahwa urutan yang dihasilkan sesuai teoritis dengan % coverage sebesar
99,51. Hasil penjajaran menunjukkan urutan tersebut adalah Sortase D yang memiliki
kekerabatan terdekat dengan Bacillus sp. Marseille-Q1617 dan R. oryzaecorticis.