Perpustakaan Digital ITB

Organohalogen merupakan senyawa organik yang mengandung minimun satu atom halogen. Senyawa ini, salah satunya adalah asam haloalkanoat, disintesis dalam jumlah besar untuk berbagai keperluan industri, seperti industri kimia, tekstil, farmasi, dan pertanian. Data yang ada menunjukkan bahwa kebutuhan organohalogen terus meningkat dari tahun ke tahun, dengan demikian limbah organohalogen yang dibuang ke lingkungan juga meningkat. Limbah organohalogen bersifat persisten dan beracun bagi banyak organisme, termasuk manusia. Oleh sebab itu, penanganan limbah organohalogen, termasuk limbah asam haloalkanoat, terus diupayakan dan dikembangkan. Bioremediasi dianggap sebagai salah satu teknik yang aman dan ramah lingkungan untuk mengurangi limbah senyawa xenobiotik ini. Bioremediasi dan biodegradasi terhadap asam haloalkanoat dapat dilakukan oleh mikroorganisme yang menghasilkan haloasam dehalogenase, suatu enzim hidrolitik yang mengkatalisis pemutusan ikatan kovalen karbon-halogen dalam asam haloalkanoat. Salah satu mikroorganisme yang diketahui menghasilkan haloasam dehalogenase adalah Pseudomonas aeruginosa ITB1. Pengembangan penelitian tentang haloasam dehalogenase dari P. aeruginosa ITB1 terus dilakukan. Gen yang mengkode pembentukan haloasam dehalogenase dari P. aeruginosa ITB1, disebut sebagai paed-d, telah berhasil diklon dan diekspresikan dalam sel inang E. coli. Haloasam dehalogenase yang dihasilkan oleh klon rekombinan ini, disebut sebagai Paed-d, juga telah berhasil dimurnikan serta ditentukan aktivitasnya terhadap asam monokloroasetat (MCA). Selain itu, studi mutasi secara in-silico terhadap paed-d juga telah dilakukan dan menunjukkan bahwa residu aspartat pada posisi 7 (D7) memainkan peran penting dalam katalisis. Untuk membuktikan hasil studi in-silico tersebut, maka pada penelitian ini dilakukan studi site directed mutagenesis menggunakan pendekatan PCR untuk mempelajari fungsi residu D7 pada proses katalisis degradasi MCA. Penelitian ini dimulai dengan isolasi koloni tunggal P. aeruginosa ITB1, dilanjutkan dengan isolasi DNA kromosomnya. DNA kromosom ini kemudian digunakan sebagai templat untuk mengisolasi paed-d dengan pendekatan PCR menggunakan primer maju Fr1 (5’ GAATTCATGCGCGCGATCCTGTTCGA-3’) dan primer mundur Rv1 (5’ AAGCTTTCAGGCCGAGGCCGCCAGTT-3’). Amplikon yang diperoleh diklon ke plasmid pGEM-T dalam sel inang E. coli TOP10, lalu disubklon ke plasmid pET-30a(+) untuk ekspresi dalam sel inang E. coli BL21 (DE3). Site directed mutagenesis D7A terhadap paed-d dilakukan dalam klon rekombinan pET-paed-d dengan pendekatan PCR menggunakan primer maju MutF (5’-GCGATCCTGTTCGCTGTGTTCGGTACC-3’) dan primer mundur MutR (5’ GGTACCGAACACAGCGAACAGGATCGC-3’). Urutan nukleotida paed-d dan paed-D7A yang diperoleh kemudian disekuens dan dianalisis. Ekspresi pET-paed-d dan pET-paed-D7A dipelajari dalam sel inang E. coli BL21(DE3) dan aktivitas haloasam dehalogenase yang dihasilkannya dipelajari menggunakan substrat MCA. Aktivitas haloasam halogenase Paed-d dan Paed-D7A diukur menggunakan metode Bergmann Sanik dengan menentukan jumlah ion klorida yang dilepaskan ke medium dalam reaksi enzimatik. Hasil penelitian menunjukkan bahwa paed-d dan paed-D7A masing-masing memiliki ukuran ~700 bp. Keberhasilan perolehan paed-D7A dibuktikan melalui analisis urutan nukleotida hasil sekuensing, yang menunjukkan bahwa basa ke 20, yaitu A telah berhasil diubah menjadi C, artinya kodon GAT telah berhasil diubah menjadi GCT, sehingga mengubah asam aspartat pada posisi 7 menjadi alanin. Hal ini berarti bahwa D7 pada Paed-d telah diubah menjadi A7 dalam Paed-D7A. Prediksi terhadap massa molekul protein yang dihasilkan oleh paed-d dan paed-D7A menggunakan Expacy Protparam memberikan hasil sebesar 26,352 kDa. Hal ini dibuktikan melalui analisis SDS-PAGE terhadap Paed-d dan Paed-D7A yang diproduksi dari klon rekombinan E. coli BL21(DE3) yakni masing-masing memberikan ~28 kDa. Paed-d mampu mendegradasi MCA sebesar 89% dengan aktivitas spesifik sebesar 27,69 (µmol Cl-/mg of protein) dan Paed-D7A mampu mendegradasi MCA sebanyak 34% dengan aktivitas spesifik sebesar 10,97 (µmol Cl-/mg of protein), artinya mutan D7A memiliki aktivitas spesifik 2,5 kali lebih rendah dibandingkan dengan wild-type. Masih adanya aktivitas haloasam dehalogenase pada Paed-D7A ini agak berbeda dengan analisis in-silico yang menunjukkan bahwa mutasi D7A akan menghilangkan aktivitasnya. Hal ini mengindikasikan adanya kemungkinan residu asam aspartat lain pada molekul haloasam dehalogenase dari P. aeruginosa ITB1 yang menggantikan fungsi D7 sebagai nukleofil. Meskipun demikian, terjadinya penurunan aktivitas pada Paed-D7A dibandingkan dengan Paed-d, menunjukkan bahwa D7 dalam haloasam dehalogenase dari P. aeruginosa ITB1 ini memiliki peran penting dalam proses katalisis. Hasil penelitian ini sejalan dengan fungsi aspartat sebagai nukleofil dalam haloasam dehalogenase dari Pseudomonas sp. YL dimana mutasi D10A telah diamati dapat menghilangkan aktivitasnya terhadap substrat L-2-cloropropionat.