Perpustakaan Digital ITB

Protein terapeutik rekombinan merupakan produk biofarmasetika yang terus berkembang dari tahun ke tahun. Produksi protein rekombinan dipengaruhi oleh jumlah salinan vektor ekspresi yang membawa gen pengkodenya. Untuk skala industri, plasmid dengan salinan rendah sedang lebih sesuai karena stabilitas plasmid lebih terjamin. Kestabilan plasmid juga dapat ditingkatkan melalui beberapa pendekatan lain, diantaranya dengan penambahan fragmen DNA cer. Pada penelitian sebelumnya telah dikonstruksi vektor ekspresi pCAD berbasis pBR322 yang bersalinan rendah sedang. Penelitian ini bertujuan untuk mengkonfimasi jumlah salinan pCAD dengan quantitative polymerase chain reaction (qPCR). Selain itu juga dilakukan penambahan fragmen cer pada pCAD yang akan digunakan pada penelitian lanjutan penetapan stabilitås pCAD. Dua pasang primer, yaitu tkd dan ori, masing-masing dirancang untuk mentarget kromosom dan plasmid. Kualitas primer dianalisis in silico, dilanjutkan dengan pengecekan in vitro spesifisitas primer, penetapan efisiensi primer, serta optimasi kondisi qPCR. Penetapan jumlah salinan plasmid dilakukan terhadap lisat sel Escherichia coli yang membawa plasmid. Plasmid pBR322 digunakan sebagai pembanding, sedangkan plasmid pJExpress414-sod digunakan Untuk menguji metode yang digunakan. Fragmen DNA cer diperoleh dari plasmid pUC57ccdA melalui PCR. Penyisipan cer ke pCAD dilakukan melalui Sisi pemotongan Psil. Kedua pasang primer untuk qPCR terbukti mampu mengamplifikasi target secara spesifik dengan efisiensi masing-masing sebesar 1,95 untuk primer tkd dan 1,97 untuk primer ori, dengan Tm produk masing-masing 79,01 + 0, I I OC dan 81,53 + 0,290C. Penetapanjumlah salinan plasmid memberikan hasil 13,1 + 0,3 salinan/sei untuk pCAD dan 576,3 + 91,9 salinan/sel untuk JExpress414-sod. Fragmen cer sebesar 284 pasang basa telah berhasil diisolasi, diamplifikasi, dan disisipkan ke pCAD serta memberikan hasil konfirmasi positif dengan analisis migrasi, pemotongan menggunakan enzim Nod, dan penentuan urutan nukleotida. Jumlah salinan plasmid rendah sedang pCAD berhasil ditentukan dan terkonfirmasi. Selain itu, pCAD telah terkonfirmasi membawa fragmen cer. pCAD-cer dan kondisi qPCR dari hasil penelitian ini dapat digunakan untuk studi stabilitas pCAD selanjutnya.