Mandai cempedak merupakan pangan lokal Kalimantan Timur yang dibuat dengan proses fermentasi alami, sehingga produk yang dihasilkan belum stabil. Optimasi fermentasi terkontrol dibutuhkan untuk menciptakan lingkungan yang mendukung pertumbuhan bakteri probiotik-halotoleran seperti bakteri asam laktat dan menghambat pertumbuhan mikroba pembusuk. Parameter yang dikontrol berupa: salinitas, suhu, dan penambahan starter mikroba untuk mempercepat proses fermentasi serta meningkatkan mutu produk. Tujuan penelitian ini yaitu: (1) menentukan konsentrasi larutan garam dan waktu fermentasi optimum mandai cempedak berdasarkan kualitas organoleptik; (2) menentukan dinamika populasi mikroba selama proses fermentasi alami dengan konsentrasi garam optimum; (3) mengisolasi bakteri asam laktat kunci dari proses fermentasi alami mandai cempedak berdasarkan kelimpahan relatif dan kemampuan enzimatisnya; (4) menentukan waktu fermentasi optimum dengan kultur starter isolat bakteri asam laktat berdasarkan kualitas organoleptik. Fermentasi dilakukan pada suhu 28oC, pH awal 5, dan rasio berat mesokarp:volume air garam sebesar 1:1. Populasi dan jumlah mikroba dihitung setiap 2 hari menggunakan media NA, MRSA, dan PDA. Uji organoleptik dilakukan berdasarkan kesukaan dari panelis tidak terlatih terhadap 5 variabel yaitu aroma, cita rasa, warna, tekstur, dan preferensi keseluruhan. Hasil penelitian ini didapatkan konsentrasi larutan garam optimum dalam fermentasi mandai cempedak sebesar 15% dengan nilai indeks organoleptik tertinggi sebelum digoreng sebesar 3,98 dan setelah digoreng sebesar 4,67. Berdasarkan hasil total enumerasi mikroorganisme pada fermentasi alami mandai cempedak dengan salinitas 15% secara berturut-turut didominasi oleh ragi dan bakteri heterotrof aerobik. Telah berhasil diisolasi mikroorganisme dengan rincian 12 isolat bakteri dan 6 isolat ragi. Isolat C dipilih
sebagai starter karena memiliki aktivitas enzimatis seperti amilolitik, selulolitik, proteolitik, dan dapat memfermentasi sukrosa, glukosa, dan laktosa. Penambahan isolat C sebesar 10% dengan kepadatan sel 106 CFU/mL mampu mempercepat waktu fermentasi dari 8 hari menjadi 6 hari berdasarkan hasil indeks organoleptik tertinggi sebelum digoreng sebesar 4,03 dan setelah digoreng sebesar 4,78. Mandai yang difermentasi secara terkontrol selama 6 hari memiliki karakteristik: aroma khas mandai cukup menyengat, sedikit aroma alkoholik, rasa asin, sedikit asam, cukup gurih, dan tekstur yang kenyal.