Biosurfaktan merupakan metabolit sekunder yang memiliki sifat aktif permukaan yang dihasilkan oleh mikroorganisme dalam kondisi nutrisi terbatas tetapi kaya akan sumber karbon berupa lipid. Saat ini, penelitian dan pengembangan biosurfaktan semakin diintensifkan sebagai upaya untuk mensubstitusi surfaktan sintetis yang kurang ramah lingkungan. Penelitian ini bertujuan untuk memanfaatkan bakteri Pseudomonas stutzeri BK-AB12 untuk mengonversi minyak inti sawit (PKO) menjadi biosurfaktan. Bakteri ini merupakan kelompok bakteri halofilik yang mampu bertadaptasi di lingkungan salinitas tinggi, sehingga pemanfaatan bakteri ini dapat menekan kontaminasi bakteri nonhalofil dan juga diharapkan mampu menghasilkan biosurfaktan yang stabil pada kadar garam tinggi. Produksi biosurfaktan dilakukan menggunakan media garam mineral (MSM) yang mengandung (b/v) 0,2% urea, 0,05% KH2PO4, 0,1% K2HPO4, 5% NaCl, 0,05% MgSO4.7H2O, 0,001% CaCl2.2H2O, 0,5% tripton dan 15% (v/v) sumber karbon berupa minyak inti kelapa sawit (PKO). Optimasi media produksi dilakukan dengan memvariasikan konsentrasi NaCl dari 1-5% (b/v), urea 0,1-0,5% (b/v) sebagai sumber nitrogen, dan PKO 10-20% (b/v) sebagai sumber karbon. Optimasi dimonitor dengan uji sebaran minyak (OST) untuk menentukan aktivitas biosurfaktan. Produk biosurfaktan yang dihasilkan juga diuji secara kualitatif dengan menggunakan media agar biru mengandung cethyl trymethylammonium bromide-methylene blue (CTAB-MB) dan dikarakterisasi dengan Fourier Transform Infra Red (FTIR). Hasil optimasi menunjukkan bahwa P. stutzeri BK-AB12 optimum menghasilkan biosurfaktan pada kadar NaCl 5% (b/v), urea 0,2% (b/v), dan PKO 15% (b/v) dengan diameter sebaran minyak yaitu 3,6 cm. Produksi biosurfaktan tertinggi pada media ini optimal teramati pada fasa akhir stationer di jam ke- 96 dengan persen hasil sebesar 0,097% (b/v). Uji agar biru dan karakterisasi FTIR terhadap biosurfaktan hasil isolasi membuktikan bahwa biosurfaktan yang dihasilkan P. stutzeri BK- AB12 adalah tipe rhamnolipid. Hasil penelitian ini memperlihatkan bahwa P. Stutzeri BK- AB12 merupakan bakteri halofil potensial yang dapat dimanfaatkan untuk produksi rhamnolipid dari sumber karbon PKO.