Perpustakaan Digital ITB

Indonesia merupakan negara tropis yang menjadi epidemi penyakit berbahaya seperti tuberkulosis (TB). Penyebab TB adalah infeksi Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) yang bisa menular langsung melalui percikan batuk atau bersin. Sebagian besar M. tuberculosis menginfeksi paru-paru karena M. tuberculosis bersifat aerob obligat, tetapi dapat juga terjadi pada organ tubuh lain, di antaranya tulang dan otak. Antibiotik yang dipakai untuk pengobatan TB di Indonesia adalah isoniazid, rifampisin, pirazinamid, streptomisin, dan etambutol. Pirazinamid menjadi obat andalan lini pertama yang dikombinasikan dengan isoniazid dan rifampisin untuk pengobatan TB dalam waktu yang singkat. Pengobatan TB semakin sulit setelah ditemukan M. tuberculosis yang resisten terhadap pirazinamid. Hasil-hasil penelitian yang ada menunjukkan bahwa resistensi M. tuberculosis terhadap pirazimanid disebabkan oleh adanya mutasi pada gen pncA sehingga mengubah asam amino penyusun pirazinamidase yang dihasilkan. Hasil ini sangat baik karena dengan demikian dapat dilakukan deteksi sifat resistensi M. tuberculosis terhadap pirazinamid dengan cara analisis genotipe gen pncA M. tuberculosis. Laboratorium Biokimia, Program Studi Kimia ITB memiliki 42 isolat klinis M. tuberculosis yang resisten multiobat (multidrug resistance; MDR). Ada 13 isolat yang resisten terhadap pirazinamid, tetapi baru satu isolat yang dianalisis penyebab resistensinya sehingga permasalahan yang diangkat dalam penelitian ini adalah apakah penyebab resistensi isolat klinis L20 dan R9 MDR-M. tuberculosis yang resisten pirazinamid pada tingkat genotipe. Ada beberapa tahapan penelitian yang dilakukan, yaitu amplifikasi, elektroforesis, penentuan urutan nukleotia (sequencing), analisis in silico hasil sequencing dan kloning. Pada penelitian ini sampel yang digunakan adalah isolat klinis L20 dan R9 MDR-M. tuberculosis. Sampel yang dipakai merupakan hasil isolasi peneliti sebelumnya yang memiliki fenotipe resisten terhadap pirazinamid. Sebagai kontrol wild type digunakan M. tuberculosis galur H37Rv. Amplifikasi menggunakan proses reaksi perpanjangan rantai (polymerase chain reaction; PCR) dengan menggunakan primer maju pncAF dan primer balik pncAR yang telah didesain oleh peneliti sebelumnya pada kelompok penelitian yang sama. Kedua primer tersebut diharapkan dapat mengamplifikasi gen pncA M. tuberculosis. Fragmen DNA hasil PCR analisis dengan elektroforesis gel agarosa dan diamati di bawah sinar UV. Setelah didapatkan pita tunggal dilakukan sequencing dengan menggunakan metode Dideoksi Sanger. Analisis in silico hasil sequencing menggunakan program SeqmanTM, DNASTAR. Penentuan posisi mutasi dilakukan dengan cara membandingkan urutan nukleotida gen pncA isolat klinis L20 dan R9 MDR-M. tuberculosis dengan M. tuberculosis galur murni H37Rv. Tahap berikutnya dilakukan kloning ke vektor pGEM-T. Elektroforesis hasil PCR menunjukkan pita tunggal dengan ukuran 0,72 kb. Urutan nukleotida hasil sequencing tiga isolat klinis L20, R9 dan H37Rv dibaca masing-masing adalah 674 pb, 650 pb dan 640 pb. Setelah dilakukan analisis in silico ditemukan adanya mutasi pada gen pncA T539C pada isolat klinis L20 MDR-M. tuberculosis, sedangkan pada isolat klinis R9 tidak ada mutasi. Mutasi substitusi T539C mengakibatkan terjadinya perubahan asam amino pada posisi ke 180 dari valin menjadi alanin. Kedua asam amino tersebut memiliki rantai samping bersifat nonpolar alifatik, yaitu gugus isopropil pada valin dan metil pada alanin sehingga kemungkinan besar perubahan asam amino ini tidak mengubah struktur 3D pirazinamidase secara signifikan sehingga dapat mengubah aktivitasnya. Hal ini juga diperkuat oleh hasil analisis struktur 3D pirazinamidase yang menunjukkan bahwa letak residu asam amino posisi 180 terletak jauh dari daerah katalitiknya. Mutasi substitusi T539C ini belum pernah dipublikasi sebelumnya sehingga hasil ini dapat memberikan informasi bahwa resistensi M. tuberculosis terhadap pirazinamid ini disebabkan oleh adanya mutasi pada gen pncA yang tersebar di sepanjang gen pncA tersebut. Sementara itu, pada isolat R9 MDR-M. tb tidak terjadi mutasi. Hasil ini semakin menegaskan bahwa selain mutasi pada gen pncA M. tuberculosis ada mekanisme resistensi M. tuberculosis lain terhadap pirazinamid. Dengan demikian perlu dilakukan penelitian lebih lanjut, seperti penentuan struktur 3D pirazinamidase untuk menentukan sisi katalitik, sisi pengikatan substrat, dan mekanisme katalisis pirazinamidase sehingga karakteristik resistensi M. tuberculosis dapat diketahui.