Perpustakaan Digital ITB

Lipase (triasilgliserol hidrolase, E.C.3.1.1.3) merupakan salah satu kelas enzim hidrolitik yang sangat penting. Enzim ini memegang peranan penting dalam industri bioteknologi dikarenakan kegunaannya yang sangat luas dalam berbagai aplikasi seperti industri makanan, kertas, detergen, farmasi, sintesis zat kimia dengan stereoisomer spesifik, biodisel, pengolahan limbah dan tekstil. Pemanfaatan lipase masih dapat ditingkatkan dengan cara menemukan atau membuat varian lipase yang lebih baik misalnya lipase yang tahan dengan kondisi ekstrim seperti temperatur dan pH. Salah satu cara untuk mendapatkan lipase dengan karakteristik biokimia yang unik adalah dengan mengisolasi dari berbagai jenis mikroorganisme, terutama jenis yang belum pernah diteliti sebelumnya. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan lipase termostabil alkali yang diproduksi oleh mikroorganisme isolat lokal Jawa Barat dengan tingkat kemurnian yang relatif tinggi dan diharapkan memiliki karakteristik biokimia yang unik. Delapan mikroorganisme termofilik isolat lokal telah diiso lasi dan dikultivasi di laboratorium. Semua mikroorganisme berasal dari sumber air panas yang terdapat di Jawa Barat, seperti Kawah Domas, Papandayan, Kahuripan dan Kawah Hujan A. Beberapa diantaranya telah diidentifikasi sebagai mikroorganisme termofilik khas (unique) Jawa Barat dan potensial sebagai penghasil lipase alkali termostabil. Kondisi lingkungan yang unik dari ke delapan isolat ini diharapkan akan menghasilkan enzim yang memiliki karakter yang berbeda-beda. Semua isolat diatas telah dilakukan penapisan secara kualitatif terhadap lipase dengan menggunakan media agar pada berbagai pH alkali. Kedelapan isolat memperlihatkan aktivitas lipolitik jika ditumbuhkan pada media agar yang mengandung minyak zaitun dan rodhamin B. Isolat DMS-3 dan KHA-P12 menunjukkan penghasil lipase dengan aktivitas tertinggi dengan adanya hallo pendar merah jingga berfluorisensi jika diamati dibawah sinar UV dengan panjang gelombang 350 nm. Intensitas fluorisensi yang tinggi menunjukkan tingginya aktivitas lipase dari kedua isolat ini. Analisis kuantitatif telah dilakukan dengan membuat kurva pertumbuhan dan aktivitas lipase dari kedelapan isolat. Aktivitas lipase diukur menggunakan metode spektrofotometri dengan p-nitrofenil palmitat sebagai substrat. Isolat DMS-3 memberikan pertumbuhan paling tinggi jika diinkubasi pada temperatur 65 oC dan 70 oC dengan kecepatan tumbuh masing-masing sebesar 1,037 dan 1,200 OD/jam. Dua isolat menghasilkan aktivitas lipase yang tertinggi yaitu isolat DMS-3 dan KHA-P12 jika diinkubasi pada 70 oC pH 9 dibandingkan dengan enam isolat lainnya. Diantara ke delapan isolat aktivitas tertinggi lipase ditunjukkan oleh isolat DMS-3 dan KHA-P12 yaitu 21,272 unit dan 11,982 unit pada 70 oC, pH 9. Berdasarkan hasil analisis kualitatif dan kuantitatif dua isolat dipilih sebagai isolat yang akan diteruskan untuk studi lebih lanjut, yaitu isolat DMS-3 dan KHA-P12. Lipase yang dihasilkan dari kedua isolat ini selanjutnya diisolasi, dimurnikan dan dikarakterisasi. Berdasarkan pewarnaan Gram dan Scanning Electron Microscopy (SEM), dua isolat merupakan bakteri gram positif yang berbentuk batang dan kedua isolat merupakan strain tunggal dengan morfologi sel yang berbeda. Berdasarkan pendekatan rybotyping oleh penelitian lain melaporkan bahwa isolat DMS-3 dari Kawah Domas memiliki kedekatan dengan Geobacillus kaustophilus sedangkan KHA-P12 dari kawah Hujan A memiliki kedekatan dengan Thermus aquaticus. Pemurnian lipase isolat DMS-3 dilakukan dengan fraksinasi amonium sulfat dan sistem kromatografi bertingkat. Isolat DMS-3 memiliki aktifitas spesifik yang tinggi pada fraksi 20-60% amonium sulfat. Pemurnian lebih lanjut dengan kolom kromatografi DEAE Sepharose Fast Flow dan Sephacril S-200 HR memberikan aktivitas spesifik yang relatif lebih tinggi, yaitu sebesar 1200,48 unit/mg protein dengan peningkatan kemurnian sebesar 54,37 kali dibandingkan ekstrak kasar enzim dengan yield sebesar 9,12 %. Analisis terhadap elektroforegram dari Native PAGE dikombinasi dengan zimografi, fraksi ini memperlihatkan ada 4 pita protein aktif. Analisis lebih lanjut dengan mengelusi masing-masing pita protein diteruskan dengan SDS-PAGE memperlihatkan pita kesatu, kedua, dan ketiga menghasilkan beberapa pita protein. Sementara pita keempat hanya menunjukkan satu pita protein. Data ini diduga bahwa isolat DMS-3 dapat mengekspresikan beberapa jenis lipase dengan karakter lipase multisubunit (heteropolimer dan homopolimer). Lipase dengan karakteristik ini belum pernah dilaporkan sebelumnya untuk genus Geobacillus sp. Lipase yang diproduksi oleh isolat KHA-P12 telah dimurnikan menggunakan fraksinasi amonium sulfat dan kromatografi interaksi hidrofobik dengan matrik HiPrep Butil FF 16/10. Enzim lipase isolat KHA-P12 memiliki aktivitas lipase yang baik pada fraksi 0-60% amonium sulfat. Kromatografi HiPrep Butil FF 16/10 dapat memisahkan lebih lanjut fraksi 0-60% amonium sulfat menjadi 2 kelompok protein lipase. Aktivitas spesifik lipase paling tinggi sebesar 19,46 unit/mg diamati pada fraksi yang dielusi dengan 80% etilen glikol dalam 1 mM bufer fosfat dengan kelipatan kemurnian sebesar 6,55 kali dibandingkan ekstrak kasar. Elektroforegram Native PAGE, SDS-PAGE dan zimografi menunjukkan bahwa isolat KHA-P12 dapat menghasilkan tiga jenis lipase. Lipase yang satu dengan lipase yang lainnya membentuk agregasi sehingga sulit untuk dipisahkan. Hasil elektroelusi dari satu pita positif lipase fraksi 80% etilen glikol telah dilakukan SDS-PAGE menunjukkan adanya 4 pita. Sementara zimografi hasil Native PAGE satu pita positif lipase ini menunjukkan pita tersebut memiliki aktivitas lipase. Karakter lipase isolat KHA-P12 menunjukkan bahwa enzim memiliki aktifitas optimum pada pH 8,5 jika diinkubasi pada temperatur 65 oC. Pengujian lipase pada pH optimum 8,5 memberikan 3 puncak optimum pada temperatur 55, 65, dan 75 oC dengan temperatur optimum pada 65 oC. Adanya tiga temperatur optimum menyarankan bahwa lipase isolat KHA-P12 mengandung lebih dari satu jenis lipase. Pada temperatur 55 oC ditemukan dua puncak pH optimum, yaitu pada pH 9 dan 10 dengan tinggi puncak relatif sama. Sementara pengujian pada temperatur optimum 75 oC, memiliki satu pH optimum teramati pada pH 8,5. Hasil ini menyarankan bahwa enzim yang aktif pada 75 oC, kemungkinan besar hanya terdiri dari satu jenis lipase. Penambahan ion Ca2+ dan Mn2 + (10 mM) masing-masing dapat meningkatkan aktivitas lipase, sedangkan Zn2+ tidak mempengaruhi aktivitas. Beberapa ion logam seperti Co2+, K+, Na+, Ba2+, Cu2+, Fe3+, Sn2+, Fe3+ (10 mM) dapat menginhibisi aktivitas lipase. Lipase KHA-P12 sangat dipengaruhi aktivitasnya oleh keberadaan dua ion logam (Ca2+ dan Mn2+). Senyawa EDTA, DTT, SDS, 10 mM juga merupakan inhibitor lipase KHA-P12. PSMF 10 mM juga dapat menurunkan 77,78% aktivitas lipase pada temperatur 75 oC pH 8,5. Data ini menyarankan bahwa lipase isolat KHA-P12 fraksi etilen glikol 80% adalah jenis serin hidrolase. Lipase isolat KHA-P12 dapat menghidrolisis substrat dengan panjang asam lemak kategori medium hingga panjang (C10 sampai C18). Lipase ini memiliki spesifisitas substrat yang tinggi terhadap p-nitrofenil miristat dan palmitat dengan aktivitas spesifik berturut-turut sebesar 9,35 dan 9,77 unit/mg protein. Lipase dengan karakter seperti ini sangat potensial untuk diaplikasikan dalam industri detergen karena dapat mendegradasi panjang rantai asam lemak yang berbeda- beda. Aktifitas yang tinggi pada substrat rantai panjang ditemukan pada lipase isolat KHA-P12 memungkinkan lipase ini untuk diaplikasikan sebagai katalis pada produksi biodiesel. Lipase isolat lokal yang dihasilkan dalam penelitian ini merupakan lipase termostabil alkali yang bekerja pada substrat dengan panjang rantai asam lemak berbeda-beda. Karakterisasi enzim menunjukkan bahwa isolat DMS-3 dan KHA- P12 memiliki karakteristik biokimia yang unik dari isolat lokal Jawa Barat. Lipase yang diproduksi dari mikroorganisme termofilik isolat lokal dapat digunakan untuk mengembangkan ilmu dasar mengenai enzim termostabil maupun peluang dalam industri bioteknologi.