Perpustakaan Digital ITB

Andrografolid yang merupakan senyawa diterpenoid utama dari tanaman sambiloto (Andrographis paniculata), diketahui mempunyai banyak aktivitas biologi diantaranya sebagai antimalaria dan anti-HIV. Studi in silico menunjukkan bahwa andrografolid dapat berinteraksi dengan plasmepsin, protease aspartat dari Plasmodium falciparum. Protease aspartat merupakan keluarga enzim protease yang menggunakan dua residu asam aspartat sebagai katalis pembelahan substrat peptida dalam sintesis protein. Plasmepsin diketahui mempunyai kemiripan struktur dengan protease HIV-1. Hasil analisis bioinformatika menunjukkan urutan asam amino pada kantung aktif plasmepsin II, dan IV mirip dengan protease HIV1 (p=0,00003). Dari data tersebut, maka disusun hipotesis bahwa andrografolid mempunyai aktivitas sebagai antimalaria dan anti-HIV yaitu karena dapat berinteraksi pada protease aspartat yang sama sebagai inhibitor protease. Secara umum penelitian ini bertujuan untuk menelaah interaksi andrografolid dengan protease aspartat, dan mendapatkan senyawa baru turunan andrografolid dengan aktivitas anti-HIV yang lebih aktif dari senyawa penuntunnya. Tahapan penelitian diawali dengan kajian in silico yang mencakup pengembangan dan validasi protokol penapisan maya berbasis struktur (PMBS), prediksi interaksi andrografolid dengan residu asam amino di dalam kantung aktif protease melalui penambatan molekul, pemodelan farmakofor, modifikasi molekul, prediksi aktivitas dan karakter absorpsi, distribusi serta toksisitas andrografolid dan senyawa turunannya. Pada tahap akhir dilakukan sintesis dan karakterisasi senyawa baru turunan andrografolid, serta uji aktivitas secara in vitro terhadap protease HIV-1. Kajian in silico diawali dengan pengembangan dan validasi protokol PMBS untuk mengidentifikasi inhibitor protease aspartat pada plasmepsin I, II, IV dan protease HIV-1. Protokol yang dikembangkan bertujuan untuk menghasilkan prosedur penambatan molekul yang valid, cepat dan terotomatisasi. Struktur kristal yang digunakan adalah 3QS1, 1SME, 1LS5 dan 1XL2 yang diperoleh dari Protein Data Bank (PDB). Program SPORES, Open Babel, PLANTS1.2, dan shell script MGLTools1.5.6 digunakan untuk preparasi awal ligan dan reseptor. Program AutoDock Vina 1.1.2 digunakan dalam proses penambatan ulang, dilanjutkan dengan program PLANTS1.2 dan PyPLIF 0.1.1 untuk penskoran ulang sidik jari interaksi. Program PyMOL dan PoseView digunakan untuk perhitungan root mean ii square deviation (RMSD) dan visualisasi hasil penambatan ulang. Validasi retrospektif dilakukan terhadap basis data inhibitor protease HIV-1 yang diperoleh dari Database of Useful Decoys Enhanced (DUD-E), di mana kualitas penapisan dihitung dari koefisien Tanimoto (Tc) dan energi bebas ikatan (Ei) yang dihasilkan. Nilai RMSD terbaik untuk plasmepsin I, II, IV dan protease HIV-1 berturut-turut adalah 1,1 Å, 1,2 Å, 1,7 Å dan 0,8 Å. Faktor pengayaan pada 1% positif palsu (EF1%) untuk Tc dan Ei adalah 18,26% dan 9,03%, sedangkan luas area di bawah kurva (AUC) untuk Tc dan Ei adalah 76,84% dan 60,95%. Protokol yang dikembangkan menunjukkan kualitas PMBS yang lebih baik dari protokol aslinya dengan nilai AUC 59,58%. Penelitian ini memberikan data awal untuk melakukan PMBS yang valid dalam mengidentifikasi inhibitor protease. Hasil penambatan molekul andrografolid pada plasmepsin I, II, IV, dan protease HIV-1 menggunakan protokol PMBS yang telah divalidasi, menunjukkan bahwa andrografolid dapat berinteraksi pada semua protease aspartat yang diuji, dengan nilai koefisien Tanimoto (Tc), energi bebas ikatan (Ei) dan konstanta inhibisi (Ki) berturut-turut adalah Tc = 0,38; Ei = -9,8 kkal/mol; Ki = 0,07 µM (plasmepsin I), Tc = 0,35; Ei = -8,7 kkal/mol; Ki = 0.42 µM (plasmepsin II), Tc = 0,31; Ei = -8,8 kkal/mol; Ki = 0,35 µM (plasmepsin IV), Tc = 0,32; Ei = -8,2 kkal/mol; Ki = 0,98 µM (protease HIV-1). Studi ini membuktikan bahwa andrografolid dapat mengikat asam amino yang penting pada kantung aktif plasmepsin I, II, IV, dan protease HIV1 dengan membentuk ikatan hidrogen, baik sebagai donor maupun akseptor dengan residu asam amino aspartat, yang menyerupai pepstatin, suatu inhibitor protease. Oleh karena itu, berdasarkan kesamaan mode ikatan andrografolid dengan pepstatin, maka andrografolid diprediksi dapat bekerja sebagai inhibitor protease pada plasmepsin dan protease HIV-1. Pemodelan farmakofor andrografolid di dalam kantung aktif protease HIV-1 divalidasi terhadap training set yang diperoleh dari DUD-E yaitu sebanyak 536 ligan aktif dan 35.750 decoys. Fitur farmakofor yang dihasilkan menunjukkan terjadinya tiga interaksi hidrofobik dan dua ikatan hidrogen dengan dua residu asam amino aspartat. Gugus hidroksil pada atom C-14 bertindak sebagai akseptor ikatan hidrogen dengan Asp29 dengan energi bebas dan jarak ikatan -9,4 kkal/mol dan 2,6 Å. Gugus hidroksil pada atom C-19 bertindak sebagai donor ikatan hidrogen dengan Asp25 dengan energi bebas dan jarak ikatan -2,3 kkal/mol dan 3,7 Å. Modifikasi molekul dilakukan berdasarkan masih adanya ruang hidrofobik kosong pada kantung aktif protease HIV-1, oleh karena itu ditambahkan gugus alkil atau hidroksibenzaldehid untuk memperpendek ikatan hidrogen dengan Asp25 sehingga kekuatan ikatan dan afinitasnya menjadi lebih besar. Modifikasi tersebut menghasilkan delapan turunan andrografolid, yaitu 12,13- dihidro andrografolid, 3-metil andrografolid, 3-etil andrografolid, 3-propil andrografolid, 3-benzil andrografolid, serta tiga turunan hidroksibenziliden andrografolid, yaitu 3,19-2’-hidroksibenziliden andrografolid (SM-1), 3,19-3’- hidroksibenziliden andrografolid (SM-2) dan 3,19-4’-hidroksibenziliden andrografolid (SM-3). Pengujian prediksi, absorpsi, distribusi dan toksisitas menunjukkan andrografolid dan turunannya diserap dengan baik di usus, memiliki permeabilitas sedang pada sel Caco-2, terikat kuat pada protein plasma dan tidak iii menunjukkan sifat mutagenik atau karsinogenik. Hasil prediksi aktivitas menunjukkan bahwa SM-1, SM-2 dan SM-3 merupakan tiga senyawa terbaik dengan afinitas yang paling tinggi pada protease HIV-1. Dalam penelitian ini telah berhasil disintesis senyawa SM-1, SM-2 dan SM-3 menggunakan reaktor sintesis gelombang mikro, dengan mereaksikan andrografolid dan hidroksibenzaldehid menggunakan katalis piridinium p-toluen sulfonat (PPTS) pada kondisi optimum suhu 50° C, kekuatan iradiasi 300 Watt, dan kecepatan pengadukan 200 rpm selama 3 jam. Pemurnian dilakukan dengan cara ditambahkan trietilamin, diencerkan dengan benzena dan kemudian dicuci dengan air 3 kali, lapisan organik dipisahkan dan dikeringkan dengan natrium sulfat anhidrat. Pemurnian lebih lanjut dilakukan dengan kromatografi kolom (silika gel 45 ~ 75 m, Wakogel C-300) dengan menggunakan kloroform - metanol (20:1) sebagai eluen. Hasil sintesis turunan andrografolid mempunyai pemerian serbuk berwarna putih, titik leleh 140-142°C (SM-1), 167-170°C (SM-2), 192-194°C (SM-3) dan rendemen 85% (SM-1) , 86% (SM-2), 86% (SM-3). Hasil karakterisasi dengan spektroskopi IR, MS, C-NMR dan H-NMR menunjukkan kesesuaian dengan struktur yang diharapkan. Potensi inhibitor protease HIV-1 diuji secara in vitro menggunakan fluorometric assay kit. Prinsip pengukuran berdasarkan kemampuan protease HIV-1 untuk memecah substrat peptida sintetik dan melepaskan fluorofor yang dapat dideteksi pada panjang gelombang eksitasi 330 nm dan emisi 450 nm menggunakan fluorescence microplate reader. Suatu inhibitor protease akan menghambat pemecahan substrat peptida dan mengurangi kadar fluorofor yang dilepaskan. Hasil pengujian menunjukkan IC50 untuk pepstatin dan lopinavir yang diisolasi dari tablet Aluvia ® berturut-turut adalah 1,61 µM dan 1,12 µM. Sedangkan andrografolid dan turunannya SM-1, SM-2, dan SM-3 memiliki IC50 yang lebih besar dari kedua standar inhibitor protease yang digunakan yaitu berturut-turut 18,14 µM; 10,72 µM; 9,93 µM; dan 8,32 µM. Data ini menunjukkan turunan andrografolid lebih aktif dari andrografolid sebagai senyawa penuntunnya, tetapi potensinya masih rendah dari kedua standar inhibitor protease. Meskipun demikian, mengingat sudah banyaknya resistensi terhadap obat-obat inhibitor protease yang ada, senyawa baru turunan andrografolid masih berpotensi untuk digunakan sebagai alternatif anti-HIV.