Perpustakaan Digital ITB

Rhodotorula toruloides, ragi merah dari subdivisi Pucciniomycotina (Basidiomycetes), merupakan mikroba yang menjanjikan untuk bioproduksi lipid (hingga 70% berat kering), karotenoid, dan berbagai senyawa penting lainnya. Pengembangan transformasi terhadap R. toruloides sudah banyak dilakukan, namun karakteristik dinding sel yang tebal, keragaman galur, dan minimnya ketersediaan protokol transformasi yang sesuai masih menjadi pembatas dalam eksplorasi potensi rekayasa genom R. toruloides isolat lokal. Elektrotransformasi menjadi metode yang menarik untuk dikembangkan karena relatif sederhana, cepat, dan dapat memberikan efisiensi tinggi. Pada penelitian sebelumnya, telah dikembangkan metode elektrotransformasi untuk R. toruloides isolat lokal, namun konsistensi dan reproduksibilitas metode tersebut masih memerlukan pengujian. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan untuk menentukan keberhasilan elektrotransformasi gen FAD2 pada R. toruloides isolat lokal menggunakan marka seleksi Sh ble dengan metode yang telah dikembangkan. Kedua gen tersebut diintegrasikan ke genom melalui integrasi acak dan dikonfirmasi melalui PCR. Pada penelitian ini, plasmid sirkular dan linear dengan jumlah masing-masing 3 ?g digunakan sebagai insert transformasi pada voltase 600V. Kurva pertumbuhan menunjukkan fase eksponensial dari jam ke-0 hingga ke-21, dengan fase stasioner setelah 21 jam sehingga pembuatan sel kompeten akan dilakukan pada pertengahan fase eksponensial dengan umur 9-12 jam dengan tujuan mendapatkan sel dengan kondisi metabolisme aktif serta struktur dinding sel dengan komposisi kitin dan manan yang relatif lebih tipis dibandingkan pada fase stasioner. Uji sensitivitas menunjukkan bahwa zeocin dengan konsentrasi 200 ppm dapat menghambat pertumbuhan isolat wild-type pada kepadatan sel 10? sel/mL. Berdasarkan konfirmasi melalui PCR, hasil menunjukkan bahwa 4 dari 5 koloni yang ditrasformasi dengan penggunaan plasmid linear terkonfirmasi memiliki fragmen FAD2 sintetik dan Sh ble pada hasil isolasi DNA-nya, sedangkan transformasi dengan plasmid sirkular menunjukkan hasil negatif pada keseluruhan koloni yang diuji sehingga penggunaan plasmid sirkular pada transformasi diduga menghasilkan transforman yang tidak stabil. Hasil ini mengindikasikan bahwa plasmid linear lebih efektif untuk elektrotransformasi pada R. toruloides isolat lokal, namun keberhasilan transformasi dengan plasmid sirkular masih memerlukan evaluasi lebih lanjut. Selanjutnya, pengujian melalui RT-qPCR terhadap FAD2 dapat dilakukan sehingga diperoleh hasil analisis overekspresi gen yang terjadi pada transforman dengan penggunaan plasmid linear.