Perpustakaan Digital ITB

Penemuan mengenai enzim baru yang aktif termasuk lipase termostabil yang dapat bekerja secara optimal dan tidak kehilangan aktivitasnya pada keadaan ekstrem merupakan prioritas tertinggi untuk berbagai aplikasi dalam industri. Penggunaan lipase termostabil memberikan banyak keuntungan karena stabilitas, aktivitas dan daya tahan terhadap kondisi ekstrem. Salah satu cara untuk memproduksi lipase termostabil adalah dengan melakukan ekspresi heterolog pada sistem Escherichia coli, namun sering mengalami permasalahan yang kompleks sehingga diperlukan kajian alternatif dengan cara mencari sistem inang baru yang lebih baik. Dalam beberapa tahun terakhir, ekspresi pada sistem eukariotik dari lipase termostabil telah dilakukan pada ragi Pichia pastoris karena memiliki banyak keunggulan dibanding dengan sistem ekspresi E. coli seperti memiliki modifikasi genetik yang mudah, produksi protein asing secara intraseluler dan ekstraseluler, modifikasi pasca translasi, dan protein yang dihasilkan memiliki stabilitas yang tinggi. Penelitian yang berfokus pada efisiensi dan keefektifan ekspresi heterolog lipase termostabil pada P. pastoris dan studi karakterisasinya masih tergolong sedikit dan belum banyak dilaporkan. Penelitian ini diharapkan memberikan keterbaruan dalam meningkatkan aktivitas lipase termostabil dan mendapatkan karakter khasnya untuk keperluan aplikasi industri. Pada penelitian ini telah dilakukan subkloning, ekspresi heterolog, pemurnian dan karakterisasi lipase termostabil dari bakteri isolat Indonesia. Dua lipase termostabil dipilih yaitu Itb1.1 dan Lk3 untuk kajian ini. Gen pengode lipase ITB1.1 dan LK3 sebelumnya berada pada plasmid ekspresi E. coli pET30a(+) yang dinamakan pET30a(+)-ITB1.1 dan pET30a(+)-LK3. Kemudian dilakukan rekonstruksi plasmid kloning pJET1.2 dengan mengamplifikasi gen pengode ITB1.1 dan LK3 dengan sepasang primer spesifik masing-masing yang memiliki sisi pengenalan restriksi EcoRI dan XbaI. Plasmid rekombinan baru dinamakan pJET1.2-ITB1.1 dan pJET1.2-LK3. Selanjutnya dilakukan subkloning gen pengode ITB1.1 dan LK3 ke plasmid ekspresi ragi P. pastoris pPICZ?A. Plasmid ekspresi rekombinan baru dinamakan pPICZ?A-ITB1.1 dan pPICZ?A-LK3. Kemudian plasmid ini ditransformasikan ke sel E. coli TOP10F’ untuk perbanyakan plasmid dan dikonfirmasi dengan metode penapisan ukuran, analisis restriksi tunggal dan ganda, koloni PCR dan sequencing. Hasil menunjukkan bahwa gen pengode lipase telah in frame dengan sinyal sekresi faktor ? dan tag polihistidin pada plasmid ekspresi ragi. Plasmid ekspresi kemudian ditransformasikan ke sel ragi P. pastoris GS115. Transformasi dilakukan dengan metode elektroporasi dan hasil transformasi ditumbuhkan pada media YPD yang mengandung antibiotik zeocin 100 ?g/mL serta diseleksi koloni yang membawa gen multikopi dengan meningkatkan konsentrasi zeocin 2000 ?g/mL. Transforman kemudian ditumbuhkan untuk memproduksi lipase Itb1.1 dan Lk3 dengan induksi metanol 0,5% (v/v) per 24 jam selama 5 hari. Supernatan sebagai ekstrak kasar lipase Itb1.1 dan Lk3 dianalisis aktivitas hidrolisis dan kadar protein dengan metode kolorimetri. Kondisi pengujian lipase Itb1.1 menggunakan substrat pNP palmitat pada suhu 70 °C dan pH 8 sedangkan lipase Lk3 menggunakan substrat pNP laurat pada suhu 50 °C dan pH 8. Hasil menunjukkan bahwa aktivitas spesifik ekstrak kasar lipase termostabil Itb1.1 dan Lk3 masing-masing sebesar 2,918 U/mg dan 0,3301 U/mg. Sebagai perbandingan, E. coli digunakan untuk mengekspresikan lipase termostabil dengan aktivitas spesifik ekstrak kasar Itb1.1 dan Lk3 masing-masing sebesar 0,5121 U/mg dan 0,0251 U/mg. Produktivitas lipase (yield) Itb1.1 dan Lk3 (8,0197 U/g/hari dan 5,1875 U/g/hari) yang diekspresikan pada P. pastoris menunjukkan hasil yang lebih tinggi dibandingkan dengan yang diekspresikan pada E. coli (2,7939 U/g/hari dan 0,3423 U/g/hari). Optimasi ekspresi lipase Itb1.1 dan Lk3 telah dilakukan dengan variasi konsentrasi penginduksi dimana lipase Itb1.1 diinduksi dengan konsentrasi metanol 2% (v/v) selama 6 hari dan lipase Lk3 diinduksi dengan konsentrasi metanol 1% (v/v) selama 5 hari. Berat molekul kedua lipase diduga masing-masing sebesar ~50 kDa dan ~32 kDa. Ekstrak kasar lipase Itb1.1 dan Lk3 kemudian dimurnikan dengan kromatografi afinitas Ni-NTA. Lipase Itb1.1 dan Lk3 murni yang diekspresikan pada P. pastoris memiliki aktivitas spesifik masing-masing sebesar 7,6836 dan 4,85 U/mg dengan peningkatan 6,4 dan 13,7 kali dibanding dengan yang diekspresikan pada E. coli. Lipase Itb1.1 dan Lk3 telah berhasil dikarakterisasi dan memiliki aktivitas hidrolisis dan transesterifikasi. Preferensi substrat untuk lipase Itb1.1 dan Lk3 adalah pNP dekanoat (C10) dan pNP laurat (C12) dengan suhu optimum masing-masing pada 85 °C dan 60 °C serta pH optimum kedua lipase adalah 9,5 dan 8. Lipase Itb1.1 memiliki termostabilitas yang lebih baik dan lebih tahan pada beberapa pelarut organik dibandingkan lipase Lk3. Lipase Itb1.1 juga memiliki toleransi yang cukup baik dengan penambahan deterjen daripada lipase Lk3. Adanya penambahan ion logam Fe2+, Mg2+, Ni2+ dan Ca2+ dapat meningkatkan aktivitas lipase Itb1.1 dan ion logam Zn2+, Ni2+ dan Fe3+ dapat meningkatkan aktivitas lipase Lk3. Adanya ion Zn2+ menurunkan aktivitas lipase Itb1.1 yang bertentangan dengan lipase dari keluarga I.5 yang memiliki karakter khas sebagai enzim yang bergantung pada Zn2+ sehingga lipase Itb1.1 diduga merupakan lipase baru dalam keluarga I.5. Demikian juga, lipase Lk3 diduga termasuk dalam keluarga I.1 yang baru dimana secara umum dengan penambahan ion Ca2+ dapat meningkatkan aktivitas lipase namun justru menurunkan aktivitas lipase Lk3 Kedua lipase ini stabil pada pelarut non polar dengan substrat metil miristat (C14:0) untuk lipase Itb1.1 dan metil linoleat (C18:2) untuk lipase Lk3 pada reaksi transesterifikasi. Adanya perubahan preferensi substrat dengan rantai karbon yang lebih panjang pada reaksi transesterifikasi dibandingkan pada reaksi hidrolisis diduga karena luas dan volum area kantong katalitik mengalami peningkatan selama reaksi transesterifikasi. Analisis biokomputasi menggunakan penambatan molekuler dan simulasi dinamika molekul serta bioinformatika berbasis peladen web telah dilakukan untuk memprediksi, mengonfirmasi dan mendukung hasilhasil eksperimen yang telah diperoleh. Dari hasil-hasil tersebut maka lipase termostabil Itb1.1 dan Lk3 memiliki potensi untuk dikembangkan lebih lanjut sebagai biokatalis industri.