Perpustakaan Digital ITB

Senyawa organohalogen merupakan golongan senyawa yang secara luas telah digunakan dalam industri pewarna, plastik, obat-obatan, pestisida, dan produk-produk industri lainnya. Limbah industri dari penggunaan senyawa ini memiliki sifat yang persisten dan stabil, sehingga senyawa ini merupakan polutan lingkungan. Selain itu, senyawa organohalogen dapat bertransformasi menjadi metabolit lain yang berbahaya bagi manusia dan organisme lain, sehingga degradasi dan detoksifikasi senyawa ini menjadi hal yang sangat penting. Proses degradasi senyawa organohalogen khususnya haloasam, dapat terjadi secara enzimatik oleh haloacid dehalogenase. Gen haloacid dehalogenase dari Klebsiella pneumoniae ITB1 (disebut hakp1) telah berhasil diisolasi dan dikarakterisasi dalam pGEM-T. Penelitian ini bertujuan untuk subkloning gen hakp1 ke vektor ekpresi pET-30a(+) dan mempelajari ekspresinya. Primer spesifik untuk subkloning memerlukan penambahan sisi restriksi yang sesuai agar didapatkan arah subkloning yang benar. Primer yang digunakan adalah 5´-GAATTCATGATCCGCGCCATCGTG-3´ sebagai primer maju dengan penambahan sisi restriksi EcoRI dan 5´-AAGCTTTC ATGCTGGGATCTGCTCC-3´ sebagai primer mundur dengan penambahan sisi restriksi HindIII. Sisi restriksi tersebut ditambahkan karena tidak dimiliki oleh gen hakp1 dalam pGEM-T dan terdapat pada multi cloning site dari vektor pET-30a(+). Tahap amplifikasi dilakukan dengan PCR menggunakan kromosom Klebsiella pneumoniae ITB1 sebagai templat, menghasilkan amplikon sebesar 0,7 kb. Fragmen ini diligasi ke pGEM-T, ditransformasi ke E. coli TOP10 dan diseleksi dengan metode biru-putih untuk menghasilkan transforman pGEM-hakp1. Fragmen gen hakp1 dalam pGEM-hakp1 kemudian disubklon ke pET-30a(+) dengan memanfaatkan kedua sisi restriksi yang telah dirancang, ditransformasi ke E. coli BL21(DE3), dan diseleksi dengan antibiotik kanamisin untuk memperoleh pET-hakp1. Konfirmasi rekombinan pGEM-hakp1 dan pET-hakp1 dilakukan dengan metode seleksi berdasarkan ukuran plasmid, PCR ulang, analisis rekstriksi, dan penentuan urutan nukleotida. Gen hakp1 dalam pET-hakp1 memiliki ukuran 690 pasang basa. Ekspresi pET-hakp1 dalam E. coli BL21(DE3) dilakukan dengan induksi IPTG. Analisis SDS-PAGE terhadap ekstrak kasar protein menunjukkan bahwa massa molekul haloacid dehalogenase (Hakp1) adalah sekitar 30 kDa. Analisis zimogram menggunakan substrat asam monokloroasetat (MCA) dan reagen AgNO3 memberikan endapan putih AgCl, menunjukkan bahwa Hakp1 memiliki aktivitas dehalogenase. Uji kuantitatif terhadap Hakp1 memberikan aktivitas spesifik 84,29 U/mg dengan temperatur optimum 40°C dan pH 9. Satu unit aktivitas spesifik haloacid dehalogenase didefinisikan sebagai jumlah enzim yang mengkatalisis pembentukan 1 ?M ion klorida per menit. Prediksi stuktur tiga-dimensi Hakp1 menggunakan program SWISS-MODEL dan I-TASSER menunjukkan motif pelipatan ?/? yang terdiri dari daerah core dan cap. Analisis prediksi sisi aktif Hakp1 menggunakan program Sequenced Annotated by Structure dan Autodock Vina menunjukkan keterlibatan Asp8, Glu10, Leu22, Phe23, Trp90, Ser125, Ser126, dan Lys159.