Biosurfaktan merupakan metabolit sekunder yang dihasilkan oleh mikroorganisme pada kondisi nutrien yang terbatas seperti fosfat dan sumber nitrogen, namun kaya akan substrat tak larut dalam air seperti alkana dan asam lemak. Sifat biosurfaktan secara umum sama seperti surfaktan sintetis, namun memiliki keunggulan yaitu dapat terbiodegradasi sebesar 3 – 80%. Salah satu mikroorganisme yang potensial dalam memproduksi biosurfaktan adalah bakteri halofilik. Bakteri halofilik adalah bakteri yang dapat hidup pada kondisi kadar garam yang tinggi. Penelitian sebelumnya mengungkapkan bahwa bakteri halofilik Pseudomonas stutzeri BK-AB12 dapat memproduksi biosurfaktan dengan jenis rhamnolipid dalam media yang mengandung minyak inti kelapa sawit (PKO) sebagai sumber karbon dan urea sebagai sumber nitrogen. Hal ini ditunjukkan dengan diameter uji sebaran minyak yang dilakukan, yaitu sebesar 3,6 cm. Namun dalam hal ini, aktivitasnya masih cukup rendah. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan untuk meningkatkan aktivitas biosurfaktan dengan cara memutasi Pseudomonas stutzeri BK-AB12 menggunakan sinar ultraviolet (UV), meningkatkan produksi dengan mengoptimasi PKO sebagai kadar sumber karbon, serta mengarakterisasi struktur bisourfaktan yang diproduksi menggunakan Fourier Transform Infrared (FTIR). Mutasi terhadap Pseudomonas stutzeri BK-AB12 dilakukan dengan variasi waktu penyinaran 5 – 30 menit. Mutan-mutan yang didapatkan kemudian ditapis dengan menggunakan uji sebaran minyak (OST). Hasil penapisan menunjukkan bahwa mutan Pseudomonas stutzeri BK-AB12 MT-03 yang dimutasi dengan sinar UV selama 25 menit merupakan mutan yang potensial dalam memproduksi biosurfaktan. Hal ini ditunjukkan dengan diameter sebaran minyak yang dihasilkan lebih besar dari wild type, yaitu sebesar 6,2 cm. Optimasi produksi biosurfaktan dilakukan dengan memvariasikan kadar PKO dari 5 hingga 25%(v/v). Hasil optimasi menunjukkan bahwa kadar PKO optimum bagi produksi biosurfaktan adalah 10%(v/v), ditunjukkan dengan diameter sebaran minyak sebesar 3,9 ± 0,1 cm dengan perolehan 0,1332 gram biosurfaktan per 200 mL media produksi. Identifikasi gugus fungsi menggunakan FTIR menunjukkan bahwa biosurfaktan yang diproduksi merupakan biosurfaktan dengan jenis rhamnolipid.