Perpustakaan Digital ITB

Transporter ABC (ATP-binding cassette) sangat penting bagi semua makhluk hidup dan terlibat dalam proses translokasi berbagai jenis substrat. Mereka tergabung dalam proses-proses penting seperti pengangkutan nutrisi, penyebaran lemak, obat, dan eksresi antibiotik, regulasi isi sel dan lain-lain. Komponen penyusun transporter ABC terdiri dari domain transmembran (transmembrane domain - TMD), domain pengikat nukleotida (nucleotide binding domain – NBD) dan domain pengikat substrat (substrate binding domain – SBD), sebagai penyusun transporter. Keberadaan SBD memungkinkan sistem ABC untuk mengikat substrat spesifik dalam proses translokasi. Dalam penulisan ini, transporter ABC yang diteliti adalah transporter asam amino glutamin (GlnPQ) dari Lactococcus lactis IL1403 yang memiliki dua domain pengikat substrat yang terhubung secara berurutan. Dimerik GlnPQ penting untuk pengangkutan glutamin/asam glutamat secara intrasel. SBD terdiri dari dua subdomain ?/? kaku yang terhubung melalui engsel yang fleksibel. Ketika terjadi pengikatan substrat, dua subdomain kaku tersebut bergerak mendekat melalui perubahan konformasi yang terjadi pada engsel. Oleh karena itu, tujuan penelitian ini adalah mengidentifikasi perubahan konformasi yang terjadi pada domain penikat substrat GlnPQ ketika terjadi pengikatan substrat. Energi transfer resonansi Förster molekul tunggal (Single-molecule Förster- resonance energy-transfer sm-FRET) digunakan sebagai alat untuk menganalisa perubahan konformasi pada SBD. Untuk tujuan ini, dua buah mutan sistein dibangun pada dua posisi berbeda yang strategis pada gen domain pengikat substrat GlnPQ. Protein SBD ditandai pada kedua sistein ini dengan fluorofor donor (Cy3B) dan akseptor (ATTO647N), lalu perubahan jarak antara kedua fluorofor ketika terjadi perubahan konformasi diamati dengan menggunakan mikroskop perubahan eksitasi laser (alternating laser excitation – ALEX). Dalam penelitian ini, populasi FRET rendah (keadaan terbuka tanpa ligan) ditemukan pada protein terlarut, sedangkan dengan penambahan substrat, populasi ini berubah menjadi populasi FRET tinggi (keadaan tertutup dengan ligan). Hasil ini mengartikan bahwa penandaan yang dilakukan pada protein pengikat substrat dapat digunakan untuk mengidentifikasi dua konformasi yang berbeda pada tingkat molekul tunggal. Konstruksi mutasi pada SBD1, SBD2, dan SBD1+2 berurutan telah berhasil dilakukan dan diekspresikan. Protein SBD juga telah berhasil dimurnikan dan ditandai dengan Cy3B (donor) dan ATTO647N (akseptor) pada posisi yang tepat. Berdasarkan struktur kristal, mutasi S451C/T369C pada SBD2 memiliki jarak antara fluorofor sebesar 4,9 nm (FRET rendah = 0,5159) untuk keadaan terbuka dan 4,0 nm (FRET tinggi = 0,6869) untuk keadaan terbuka. Pada keadaan terbuka dan tertutup dengan penambahan glutamin pada konsentrasi jenuh, teramati satu buah puncak tunggal. Dekat dengan nilai KD ~ 1,0 µ M, populasi kedua spesies, terbuka dan tertutup dapat teramati dengan jelas. Hasil yang sama ditemukan pula pada posisi penandaan yang berbeda, yaitu GlnPQ-SBP2 (mutasi H319C/T392C), and GlnPQ-SBP1 (mutasi Q87C.T159C). Hal ini menandakan bahwa mekanisme pengikatan substrat tidak tergantung pada posisi penempatan fluorofor. Antara SBD1 dan SBD2 tidak ditemukan kekerjasamaan ketika mengikat substrat.