Perpustakaan Digital ITB

Sukrosa isomerase (SIase) dari Klebsiella pneumoniae merupakan enzim yang mengkatalisis reaksi isomerisasi sukrosa menjadi isomaltulosa. Isomaltulosa terdiri dari glukosa dan fruktosa yang dihubungkan oleh ikatan ?-1,6- glikosidik. Berbeda dengan sukrosa, isomaltulosa aman untuk kesehatan gigi karena mampu menghambat pembentukan glukan tak terlarut, stabil pada kondisi asam, kurang higroskopis dan non kariogenik. Isomaltulosa memiliki waktu hidrolisis dan penyerapan yang lebih lama sehingga tidak mengakibatkan kadar glukosa dalam darah dan respons insulin meningkat dengan signifikan. Dengan demikian, isomaltulosa tidak menyebabkan diabetes. Karena kelebihannya tersebut, isomaltulosa menjadi kandidat yang tepat sebagai pengganti sukrosa. Hal ini menyebabkan SIase banyak digunakan dalam industri untuk menghasilkan isomaltulosa. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk memaksimalkan produksi SIase dengan cara kloning gen pengkode SIase dari Klebsiella pneumoniae ke dalam vektor ekspresi pTXB1 dan melakukan uji aktivitas enzim SIase dari Klebsiella pneumoniae yang diekspresikan pada Escherichia coli BL21(DE3). Pada penelitian sebelumnya, telah didapatkan sekuens lengkap gen pengkode SIase dari Klebsiella pneumoniae yang hidup di mangga kultivar Cangkir. Gen ini kemudian diklon ke dalam vektor ekspresi pTXB1 dengan menggunakan teknik In Fusion PCR cloning. Induksi ekspresi gen pengkode SIase dilakukan dengan menambahkan IPTG dengan konsentrasi akhir 0,4 mM saat kultur sel mencapai OD600 0,5. Kultur sel kemudian diinkubasi kembali pada suhu 37oC selama 4 jam. Kultur sel kemudian dipanen dengan sentrifugasi lalu pellet diresuspensi dengan buffer kolom. Dari suspensi sel tersebut dilakukan uji aktivitas enzim dengan iv mereaksikan 50 ?L suspensi sel dengan 200 ?L sukrosa 4% (w/v) dan 250 ?L natrium sitrat pH 6,0, lalu dibiarkan 10 menit pada suhu 30oC. Isomaltulosa merupakan gula pereduksi sehingga untuk menghentikan reaksi dan mendeteksi gula pereduksi yang terbentuk, ditambahkan 500 ?L reagen DNS dan diinkubasi pada air mendidih selama 10 menit. Sampel kemudian diukur dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang ? 575 nm. Dari hasil pengukuran tersebut, didapatkan aktivitas enzim adalah 3.844,2 U/mL. Pada percobaan uji aktivitas enzim didapatkan bahwa aktivitas enzim dari fraksi ekstraseluler adalah 0 U/mL, sitoplasma adalah 46,1 U/mL, periplasma 1 adalah 16,6 U/mL, periplasma 2 adalah 79,9 U/mL, membran dalam adalah 15,1 U/mL dan membran luar adalah 2.457,8 U/mL. Dari data di atas dapat disimpulkan bahwa enzim SIase Fusion paling besar dtranslokasikan ke membran luar.