Ganoderma boninense merupakan fungi patogen pada tanaman kelapa sawit yang dapat menyebabkan basal stem rot (BSR) sehingga sulit untuk dibasmi. Penyakit yang mematikan pada tanaman ini telah menyebabkan kerugian besar pada industri minyak sawit dan belum ditemukan solusi yang tepat hingga saat ini. Cara pengendalian yang dapat dilakukan terhadap G. boninense yaitu salah satunya dengan agen kontrol biologis. Tujuan penelitian ini adalah menentukan waktu inkubasi kultur terbaik B. subtilis untuk menghasilkan senyawa metabolit anti fungi dan enzim hidrolitik (β-glukanase dan chitinase) sebagai penghmabat G. boninense serta mengevaluasi kondisi pH dan suhu yang tepat terhadap aktivitas glukanase dan kitinase, disamping menentukan pelarut yang tepat (metanol, etil asetat, dan heksan) untuk mengekstrak antifungi tersebut. Hasil yang diperoleh yaitu enzim β-glukanase dapat diproduksi secara optimum (dengan aktivitas spesifik 4.222 U/mg-protein) setelah 28 jam inkubasi. Suhu dan pH optimum dari aktivitas β-glukanase yang diperoleh yaitu pada pH 7,5 dan suhu 45°C, yang diaktivasi dengan 1% laminarin. B. subtilis menunjukkan aktivitas kitinase spesifik optimum (0.0514 U/mL) setelah 8 jam inkubasi. Aktivitas enzim kitinase yang optimum diperoleh pada pH 6,0 buffer fosfat dan suhu 40 °C, yang diaktivasi dengan 1% kitin koloid. Selanjutnya diperoleh hasil bahwa extrak kasar β-glukanase secara signifikan dapat menghambat pertumbuhan miselium G. boninense lebih baik daripada ekstrak kasar kitinase dengan inhibisi 47.75 %. Juga diperoleh hasil bahwa pelarut paling baik dalam mengekstrak metabolit dari B. subtilis yaitu etil asetat dengan nilai inhibisi sebesar 38.91%. Produk antifungi dari B. subtilis dapat digunakan sebagai agen kontrol biologis yang potensial terhadap patogen G. boninense pada tanaman kelapa sawit.