Perpustakaan Digital ITB

Caged-FRET (caged Förster-Resonance Energy Transfer) merupakan suatu metoda yang telah terbukti dapat digunakan dalam riset biologi yang berbasis pada pencitraan menggunakan fluorofor yang telah dipadamkan sebelumnya atau fluorofor photoswitchable. Reaksi pemadaman revesibel beberapa fluorofor tertentu dapat dilakukan dengan caging reduktif menggunakan agen pereduksi tertentu, seperti tris(2-karboksietil)fosfin dan sodium borohidrat. Reaksi reduksi spesifik digunakan untuk mendeaktivasi fluorofor organik yang kemudian dapat diaktivasi kembali menggunakan sinar pada panjang gelombang ultraviolet (UV). Prinsip ini dapat diaplikasikan untuk memperluas jangkauan penelitian di bidang smFRET (single-molecule FRET). Penelitian ini dilakukan untuk membuktikan bahwa caging dan/atau aktivasi kembali dengan sinar UV dapat dikombinasikan dengan analisis berbasis smFRET menggunakan mikroskop konfokal untuk meningkatkan kualitas informasi yang diperoleh sehingga analisis atas spesi biokimia kompleks dapat lebih mudah untuk dilakukan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa aktivasi kembali dari suatu fluorofor rhodamin photoswitchable (cage552) dan caging yang diikuti dengan aktivasi kembali atas fluorofor sianin (cy5) pada asam nukleat sintetis, yang mengandung lebih dari dua penanda fluoresens, dapat memberikan informasi tambahan yang pada awalnya tidak didapatkan ketika eksperimen ALEX-smFRET (alternating laser excitationsmFRET) dilakukan tanpa adanya caging dan/atau aktivasi kembali. Selain itu, ditemukan pula bahwa penghilangan atas spesi yang tidak diinginkan dari protein multi-subunit, BetP S516C, yang dilabel pada setiap subunitnya, dapat dilakukan dalam dua tahapan kerja. Langkah pertama adalah dengan memvariasikan rasio pelabelan, dengan rasio optimal 2:5. Protein yang telah terlabel kemudian dipadamkan dengan TCEP untuk menghilangkan seluruh spesi yang tidak diinginkan, dilanjutkan dengan pengukuran menggunakan teknik ALEXsmFRET. Kondisi optimal untuk BetP S516C adalah pada pH 9 dengan 1.5 mM TCEP dan waktu inkubasi selama 2 jam.